1、安康青蛙一只; 实验器材和药品:蛙类手术器械一套粗剪刀一把,组织剪一把,眼科剪一把,镊子一把,探针一根、玻璃分针2把,蛙钉4个、培养皿一个,蛙板一个、滴管一个、棉线假设干,力换能器,肌槽,刺激电极,铁架台,生物信号采集处理系统,微机,任氏剂。四实验步骤 捣毁蟾蜍脑脊髓:取蟾蜍一只,用自来水冲洗干净。左手握蛙,用食指下压头部前端,拇指按压背部,使头前俯。中指与无名指夹其前肢,无名指与小指夹其后肢,使整个躯干做最大屈曲。把探针自枕骨大孔处垂直刺入,到达椎管,即将探针改变方向刺入颅腔,向各侧不断搅动,彻底捣毁脑组织;再将探针原路退出,刺向尾侧,捻动探针使其逐渐刺入整个椎管,完全彻底捣毁脊髓。脊髓破坏
2、完全的标志是:下颌呼吸运动消失,反射消失,四肢松软。 剪除躯干上部和脏,去皮,制备下肢标本: 用粗剪刀在骶髂关节前1厘米处剪断脊柱,握住蟾蜍下肢,沿躯干两侧避开坐骨神经剪开腹壁。此时躯干上部及脏即全部下垂。剪除全部躯干及脏组织。剪去肛周皮肤;用圆头镊子夹住脊柱,注意不要碰到坐骨神经,捏住皮肤边缘,逐步向下牵拉剥离皮肤。将全部皮肤剥除后,把标本置于盛有任氏液的培养皿中。 2.1.1.3洗净双手和用过的全部手术器械。别离两下肢: 避开坐骨神经,用粗剪刀从背侧剪去骶骨,然后沿中线将脊柱剪成左右两半,再从耻骨联合中央剪开,将已别离的标本浸入盛有任氏液的培养皿中。 2.1.1.5 取出一下肢,用蛙钉固定
3、于蛙板上,固定时要注意,坐骨神经和腓肠肌朝上。先用玻璃分针沿脊柱侧游离坐骨神经腹腔部,然后循股二头肌和半膜肌之间的坐骨神经沟,纵向别离暴露坐骨神经之大腿局部直至腘窝,在别离过程中,把神经周围的结缔组织去除干净,并把神经的细小分支剪断,但要注意不要用金属器械碰触神经,也不要对神经过度牵拉。实验期间应不断滴加任氏液使神经保持湿润。用玻璃分针游离腓肠肌,并在下面穿线,在跟腱处打结。在结扎线的下方剪断跟腱,在膝关节处把除腓肠肌外的小腿其他局部剪除。注意保持完整的腓肠肌。 2.1.1.7用棉线在靠近脊柱的位置结扎坐骨神经,并在结扎线的上方剪断神经,用眼科剪剪断坐骨神经的全局部支。从腘窝处开场剪掉大腿所有
4、的肉,尽量把股骨刮干净,在膝关节上至少1cm处剪去上段股骨。将标本浸入任氏剂的培养皿中。实验装置与仪器连接:1.将标本股骨残端固定在肌槽上的小孔;2.将结扎腓肠肌肌腱的棉线与力换能器连接,调节棉线的松紧,要与桌面垂直;3.将神经置于肌槽的刺激电极上,用任氏剂保持标本湿润;4.刺激电极插入微机上的刺激输入孔;5.力换能器与微机相应通道相连。翻开电脑,进入生物信号采集处理系统,在菜单栏选择“实验工程-?“神经肌肉-?“刺激强度与反响的关系实验模块点击开场,调节刺激参数,使频率自动逐渐递增,串间隔为2.连续记录不同频率时的肌肉收缩曲线。五结果与分析不同频率刺激对肌肉收缩的影响:串间隔为2,频率增量为
5、1时的力变化如图可见单收缩、不完全强直收缩、完全强直收缩。分析:刺激强度到达阈刺激时腓肠肌开场收缩,在最大刺激收缩力前随刺激强度增大而增大,到达最大刺激强度后,收缩力不发生明显改变;在最大刺激强度条件下,某较小频率使腓肠肌发生单收缩(如图中第一次刺激),频率增大到,单收缩变为不完全强直收缩如图中第2-6次刺激,频率继续增大,不完全强直收缩变为完全强制收缩如图中第7、8次刺激。不同的腓肠肌其阈刺激,最大刺激均存在差异;其单收缩,不完全强直收缩和完全强直收缩所要频率也不尽一样。六实验总结本次试验严格按照操作步骤进展,所得实验结果较为理想,很容易观察到腓肠肌的单收缩、不完全强直收缩、完全强直收缩现象
6、。在实验的过程中,制备坐骨神经-腓肠肌标本是最繁琐的步骤,也是实验成功的关键所在,期间,我们进展的比拟缓慢,生怕弄错了哪一步,一步步想原理、回忆教师是怎么说的,所幸的是我们最终成功了,得到了较好的结果,在这次的不断尝试和思考中,很好地锻炼了我们的动手能力和思维能力。离体蛙心灌流一、【目的要求】 1、学习斯氏离体蛙心灌流法;2、了解心肌的生理特性;3、观察Na+,K+,Ca2+及肾上腺素(Adr),乙酰胆碱(ACh)等对离体心脏活动的影响。二、【原理】 将离体蛙心失去神经支配的蛙心保持在适宜的环境中,在一定的时间仍然能够保持节律性收缩,心脏正常的节律性活动需要一个适宜的理化环境,离体心脏也是如此
7、,离体心脏脱离了机体的神经支配和全身体液因素的直接影响,可以通过改变灌流液的某些成分,观察其对心脏活动的作用。心肌细胞的自律性、兴奋性、传导性及收缩性,都与钠、钾及钙等离子有关。血钾浓度过高时高于7.9mmol/L,心脏兴奋性、自律性、传导性及收缩性都下降,表现为收缩力减弱、心动过缓和传导阻滞,严重时心脏可停搏于舒期。血钙浓度升高时,心脏收缩力增强,过高可使心室停搏于收缩期。血钙浓度降低,心肌收缩力减弱。血中钠离子浓度的轻微变化,对心肌影响不明显,只有发生明显变化时,才会影响心肌的生理特性。肾上腺素可使心率加快、传导加快及心肌收缩力增强,乙酰胆碱那么与肾上腺素的作用相反。 三、【实验仪器】 青
8、蛙、 常用手术器械、蛙板(或蜡盘)、蛙心夹、计算机采集系统、力传感器、支架、双凹夹、双针形露丝刺激电极、滴管、培养皿(或小烧杯)、纱布、棉线、橡皮泥、任氏液。蛙心套管(斯氏套管或八木氏套管)、套管夹、065NaCl、5NaCI、2CaCl2、1KCl、1:5 000肾上腺素、1:10 000乙酰肌碱、300UmL肝素。四、【方法与步骤】 1、斯氏蛙心插管法 1一只青蛙,双毁髓后背位置于蜡盘中,按前面的方法暴露心脏。仔细识别心脏周围的大血管(见右图)。在左主动脉下方穿一线,于动脉圆锥处结扎(动物个体小时,结扎位置可靠上些)。再从左右两主动脉下方穿一线,并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线,右
9、手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。选择大小适宜的蛙心套管,然后将盛有少量(套管23 cm高度)任氏液(参加一滴肝素溶液)的斯氏蛙心套管,山开口处插入动脉圆锥(见右图)。当套管尖端到达动脉圆锥基部时,应将套管稍稍后退,使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进,经主动脉瓣插入心室腔(于心室收缩时插入,但不可插得过深,以免心室壁堵住套管下口)。此时可见套管中血液冲人套管,并使液面随心脏搏动而亡下移动,说明操作成功(否那么需退回并重新插入)。用滴管吸去套管中的血液,更换新鲜任氏液。稳定住套管后,轻轻提起备用线,将左、右主动脉连同插入的套管用双结扎紧(不得漏液),再将结线固定在套管
10、的小玻璃钩上,然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏,看清静脉窦的位置,于静脉窦下方剪断有牵连的组织,仅保存静脉窦与心脏的联系,使心脏离体(切勿损伤静脉窦)。用任氏液反复冲洗心室余血,使套管灌流液不再有残留血液。保持套管液面高度一致(1.52 cm),即可进展实验。2将插好离体心脏的套管固定在支架上,用蛙心夹夹住少许心尖部肌肉 (不可夹得过多,以免因夹破心室而漏液)。再将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与力传感器相连如右图。注意:勿使灌流液滴到传感器上。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。2、 实验观察 (1)记录正常心搏曲线 (2)改用065NaCI溶液灌流,并作好加药标记,观察心搏变化。待
11、曲线 氏插管装置出现明显变化时,立即吸去套管中的灌流液,同时做好冲洗标记,并用新鲜任氏液清洗23次,待心搏恢复正常。换液时切勿碰套管,以免影响描记曲线的基线,同时保持灌流液面一致(以下同)。 观察可得,NaCI溶液会阻遏心脏搏动。(3) 迅速用新鲜任氏液清洗23次,待心搏恢复正常。向套管参加13滴2CaCI:溶液,观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时,立即更换任氏液,待心搏恢复正常(如果恢复缓慢,可屡次冲洗)。(4)同法向套管中加12滴1KCl溶液,记录心搏曲线的变化。留神搏曲线变化时,同法更换灌流液,待心搏恢复正常。(5)同法记录套管中参加l2滴的肾上腺素溶液(1:10 000)后心搏
12、曲线的变化。(6)同法记录套管中参加12滴乙酰胆碱溶液(1:五、【实验结果与原因分析】 曲线的幅度收缩的程度 曲线的密度心率 曲线的基线舒的程度 1、正常收缩曲线图 2、滴加含钠离子溶液图 滴加Na离子溶液后,心跳减弱,这种现象出现的原因是由于灌注液中缺乏Ca2+,当Na明显增高时,膜外钠离子的浓度梯度增大,因此,细胞Na离子流加快,去极速度和幅度均增加,导致传导性和自律性增高。同时,Na离子流的增多促进细胞Ca2的外运使细胞Ca2浓度降低,因此,心肌收缩能力减弱。3、 滴加2%CaCl溶液 细胞外Ca2在细胞膜上对Na流有竞争性抑制作用,称为膜屏障作用。Ca2 增高时,Na流受抑制,细胞0期
13、除极速度与幅度减小,使兴奋性及传导性均降低。Ca2 增高使Ca2流增多,因此慢反响细胞0期去极化加快加强,传导性增高,而快反响细胞平台期缩短,有效不应期缩短,复极加速。Ca2流增多,使心肌收缩能力增强。Ca2 降低时,所引起的变化与高钙时相反。因此参加CaCl2后,心率减少、振幅减少,基线上移。4、滴加1%KCl溶液 滴加1KCl后的心搏曲线,曲线的频率逐渐减小,愈来愈疏,幅度逐渐下降,最后停顿在基线处,即心脏停博于舒状态。因为当细胞K+浓度增高时,K+与Ca2+有竞争性拮抗作用,K+抑制细胞膜对Ca2+的转运,使进入细胞Ca2+减少,心肌的兴奋收缩偶联过程减弱,心肌收缩力降低。所以心搏曲线振
14、幅减小。5、 滴加1:10000肾上腺素溶液 滴加肾上腺素后,蛙心收缩增强,心脏舒完全,描记的心搏曲线幅度明显增大。其作用机理是,肾上腺素可与心肌细胞膜上的B受体结合,提高心肌细胞和肌浆网膜Ca2+通透性,导致肌浆中Ca2+浓度增高,使心肌收缩增强。另外,肾上腺素还有降低肌钙蛋白与Ca2+亲和力,促使肌钙蛋白对Ca2+的释放速率增加,提高肌浆网膜摄取Ca2+的速度,刺激Na+与Ca2+交换,使复极期向细胞外排出Ca2+的作用加速,这样,将使心肌舒速度增快,整个舒过程明显增强。6、 滴加1:10000乙酰胆碱溶液 上图可示,蛙心收缩减弱,心率减慢,最后出现蛙心停顿舒阶段。其机理为:乙酰胆碱与心肌细胞膜M受体结合,一方面提高心肌细胞膜K+通道的通透性,促使K+外流,将引起:1窦房强细胞复极时K+外流增多,最大复极电位绝对值增大;Ik衰减过程减弱,自动除极
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