基因工程试验综合.docx

1、基因工程试验综合实验一 大肠杆菌基因组DNA提取与检测一、目的要求1学习并掌握用试剂盒提取细菌基因组DNA； 2. 学习使用分光光度计检测基因组DNA浓度二、基本原理 本实验利用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA。该试剂盒采用了溶菌酶裂解细胞，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖、脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化细菌基因组DNA。三、实验材料1.实验菌株：大肠杆菌TG12.实验试剂：LB液体培养基TaKaRa MiniBEST Bac

2、terial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒 无水乙醇3.实验仪器：移液枪，低温离心机，水浴锅，eppedorf管，振荡器四、操作步骤1. 大肠杆菌的培养： 从平板培养基上挑选单菌落接种至14 ml的液体培养基中过夜培养。 2. 取14 ml的过夜培养菌液，10,000 rpm离心2分钟，弃上清。 3. 用150 l的SP Buffer（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex） 等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4. 加入20 l的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5分钟。 5. 加入30 l的

3、EDTA Buffer，均匀混合后室温静置5分钟。 6. 加入200 l的Solution A，剧烈振荡后65保温10分钟。 注） 若Solution A出现沉淀，请于65加热溶解， 待恢复至室温后使用。 65保温10分钟后，溶液将由乳浊液变成透明液。如果此时溶液没有变成透明，说明细菌没有裂解，基因组DNA将不能释放。 7. 加入400 l的Solution B，剧烈振荡15秒。注） 若Solution B出现沉淀，请于65加热溶解，待恢复至室温后使用。 8. 加入650 l的Solution C，上下颠倒均匀混合。 9. 12,000 rpm离心1分钟。 10. 先弃去上层有机相，然后将水相

4、溶液（无色下层）移入预先置于1.5 ml离心管上的Filter Cup中，12,000 rpm离心1分钟。 注）有机相（上层）请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上。 11. 弃Filter Cup，在滤液中加入450 l的DB Buffer，混合均匀。 12. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 13. 将上述操作11的混合液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 14. 将500 l的Rinse A加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 15. 将700 l的Rinse B

5、加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。 注）请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。 请沿Spin Column管壁四周加入Rinse B，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。 16. 重复操作步骤15。 17. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。 18. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 l的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。 注）把水或Elution Buffer加热至65使用时有利于提

6、高洗脱效率。 19. 12, 000 rpm离心1分钟洗脱DNA。20. 取5 l DNA洗脱液用琼脂糖电泳进行检测20. 取10 l DNA洗脱液用分光光度计检测其浓度及纯度，其余-20保存 实验二 基于16S rRNA基因的PCR扩增、电泳和胶回收一、实验目的1. 了解PCR扩增DNA的技术及原理；2. 学习PCR扩增仪的使用；3. 学习琼脂糖凝胶的制备和电泳方法；4. 了解DNA胶回收的原理及方法。二、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，16S rDNA基因同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法。细菌中包括三种核糖体RNA，

7、分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16S rRNA 的基因，长度为1540bp，相比较5S rRNA和23S rRNA而言，长度适中，又具有保守性和存在的普遍性，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对细菌进行测序分析。16S rDNA鉴定是利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA的提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DN

8、A测序、序列比对等步骤，是一种快速获得细菌种属信息的方法。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是在引物指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应，是一种体外DNA扩增技术。PCR的工作原理（图1）类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲

9、体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3端开始按53方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性复性延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，变性温度为95，复性温度为3755，延伸合成温度为72，DNA聚合酶为Taq酶（可耐受95左右的高温而不失活），反应循环数为30。图1 PCR反应原理PCR是否成功，需要利用琼脂糖电泳进行检测。

10、琼脂糖电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。PCR后往往有非特异条带出现，为了获得专一的目的条带，所要对PCR产物进行切胶回收。胶回收是利用特殊硅基质材料在高盐、低pH值情

11、况下吸附DNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA的原理纯化获得目标DNA。DNA胶回收后同样需要利用电泳进行检测。三、实验材料1、实验器材PCR扩增仪，台式高速离心机，移液器，灭菌后的PCR管，电泳仪，凝胶成像仪等。2、实验试剂（1）模板DNA（0.1g/l）。（2）Taq DNA聚合酶（5U/l），10扩增缓冲液，dNTP（1mmol/l）（3）引物27F（5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3）和518R（5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3）（20 mol/l）（4）TAE缓冲液（50）（pH8.0）：每升溶液中含有242g Tris，57.1ml

12、冰乙酸，100ml 0.5mol/l EDTA。电泳时稀释成1 浓度使用。（5）溴酚兰-甘油指示剂：先配制0.1%溴酚兰水溶液，然后取1份0.1%溴酚兰溶液与等体积的甘油混合即成。（6）0.5g/ml 溴乙啶染液：称取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml，取1ml此溶液用1TAE缓冲液稀释到1升，最终浓度为0.5g/ml。（7）琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根，中国）四、实验步骤1、准备PCR反应溶液（1）按以下次序，将下列成分在0.5ml灭菌Eppendorf管内混合：模板DNA 1l10扩增缓冲液 5l4dNTPs(包括四种dNTP, 100 mol/l) 1l27F 1l518R 1lTa

13、q DNA聚合酶 1l (2.5U)加水至终体积 50l（2）用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。（3）加石蜡油10l封住溶液表面。2、PCR扩增反应将混有菌体的PCR管置于PCR扩增仪内，955分钟，使模板DNA完全变性。然后按95变性30秒，50退火45秒，72延伸2分钟，重复循环30次，循环结束后72延伸10分钟。反应完毕，将样品取出置-4待用。3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（1）制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。在

14、室温放置0.51h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。（2）加样：取5l PCR产物，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。同时另取一个已知分子量的标准DNA水解液，在同一凝胶板上进行电泳。（3）电泳：维持恒压100V，电泳0.51h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。（4）染色：将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.51h。染液可反复多次使用。（5）观察：将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察，DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。4、PCR产物胶回收使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请

15、参照瓶上的标签。（1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 l平衡液BL，12,000 rpm (13,400g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。（3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 l，则加入100 l PN溶液），50水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解 (若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (13,400g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：吸附柱容积