分散液液微萃取气相色谱质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药文档格式.docx

1、 鼠药； 气相色谱-质谱； 同时测定 1 引 言 生物碱和鼠药均可引起急性中毒，危及人体安全。我国民间常使用中草药浸泡药酒，甚至以此“进补”，容易因误食、过量使用而引发急性中毒；不法分子利用含有毒生物碱的中草药用于谋杀而引起的中毒事故屡有发生。另外，由于鼠药导致的食物中毒事件频繁发生。部分鼠药和生物碱中毒的临床症状相似，如毒鼠强与东莨菪碱中毒初期症状均有视力模糊、心跳紊乱等症状。当疑似有毒生物碱或鼠药中毒事件发生时，医生仅根据患者的临床表现进行诊断，可能存在误诊的风险。实验室检验能在短时间内检测出致毒物质，让中毒患者得到及时的对症抢救，还可为公安机关侦破案件提供技术支持。因此，建立快速、准确的

2、生物碱和鼠药同时筛查的方法具有较好的实用意义。目前，对有毒生物碱和鼠药的研究多针对单一生物碱或鼠药。有毒生物碱和鼠药的常用分析方法包括薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS/LC-MS/MS）、毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱（CE-ESI-TOF-MS）等。TLC和LC无法对目标物进行结构定性，而LC-MS/LC-MS/MS和CE-ESI-TOF-MS价格昂贵，较难在一般实验室普及。GC-MS具有价格适中、分析速度快、可对目标化合物进行准确定性的优点，在一般实验室中普及率较高。尚未见对上述5种生物碱和3种鼠药采用GC-MS

3、同时检测的报道。另外，中毒样品的前处理多采用液-液萃取、固相萃取等方法，这些前处理方法需求样品量较大、操作繁琐，耗时， 消耗试剂较多，不能很好地适应中毒应急检测的需要。分散液-液微萃取技术（DLLME）是由Rezaee等于2006年提出的一种环保、高效、简便、成本低、富集倍数高的样品富集技术。目前，DLLME已被广泛应用于不同基质样品痕量分析。本研究对DLLME过程中的各种影响条件进行优化，采用GC-MS检测方法，成功将其应用于水、尿液、黄酒及米饭等模拟毒样品中鼠药和生物碱的同时测定。2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Trace GC Ultra-ISQ气相色谱-质谱联用仪（美国Thermo

4、Fisher公司）； HS20500D离心机（中国恒奥公司）； 漩涡振荡器（美国SI公司）； Milli Q Biocel A10超纯水系统（法国Millipore公司）； 生物碱及鼠药标准：莨菪碱、东莨菪碱（98.87%，TRC公司）； 马钱子碱（98.87%）、士的宁（99.5%），Chem Service公司）； 钩吻素甲（98.87%）、毒鼠强（99.5%）、溴鼠灵（98.87%）、溴敌隆（99.5%）均由北京世纪奥科生物技术有限公司提供；甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、氯苯、二硫化碳（分析纯，广州化学试剂厂）；混合标准储备液中各目标物浓度见表1。空白水样为自来水；空白尿样

5、由志愿者提供；空白酒样为客家黄老酒（广东省河源市紫金县紫金实业发展有限公司）；空白饭样为熟米饭。2.2 疑似中毒模拟样品制备与处理 2.2.1 样品制备 分别取空白水样、尿样、酒样1 mL，米饭样1 g于15 mL离心管中，加入适量目标物混合标准溶液，振荡摇匀，得到模拟中毒样品。2.2.2 样品处理 经2.2.1节处理后的样品，加入10 mL 5%（w/V）NaCl溶液，经NaOH溶液调节至pH 8。米饭样品先经离心，取上层清液5 mL再进行后续步骤。将100 L氯仿和600 L甲醇的混合液快速注入样品中，获得浑浊、雾化乳浊液。10 s后8000 r/min离心5min，取下层有机相进行测定。

6、2.3 色谱与质谱条件 色谱条件：色谱柱：DB-5MS UI毛细管柱（30 m0.25 mm0.25 m），进样口温度：280 ；柱温升温程序：初始温度80 ，保持1 min，以20 /min升温到280 ， 保持23 min，再以40 /min升温到300 ， 保留1 min；质谱条件：离子源温度：传输线温度：EI电压：70 eV；选择离子模式测定，各种待测物选择离子见表1。3 结果与讨论 3.1 样品前处理条件的优化 3.1.1 萃取剂种类与体积的选择 传统的分散液-液微萃取常采用密度高于水且在水中溶解度小、对目标成分具有良好萃取能力、色谱出峰不影响目标物的有机溶剂作为萃取剂。本实验分别考

7、察了氯苯、二硫化碳、氯仿和四氯化碳4种有机溶剂作为萃取剂时目标物的回收率。图1A表明， 氯仿对8种目标物均具有较好的萃取效率。因此，选氯仿作为萃取剂。考察氯仿体积在40120 L时各目标物的回收率，如图1B所示，大多数目标物在100 L时达到最佳萃取效果，因此，选择氯仿的优化体积为100 L。 3.1.2 分散剂种类与体积的选择 分散液-液微萃取要求分散剂与萃取剂和水均可混溶，两者混合加入，使萃取剂以微小液滴高度分散于水相中，增大两相接触的比表面积，有效缩短萃取时间，同时提高萃取效率。本实验分别考察了丙酮、乙腈、甲醇、四氢呋喃作为分散剂时目标物的回收率。结果表明，甲醇对大多数目标物有较好萃取效

8、率，选取甲醇作为分散剂并考察其在4001500 L范围内对回收率的影响，发现甲醇的体积为600 L时目标物回收率较高。因此，选择甲醇的优化体积为600 L。3.1.3 pH值及盐浓度的影响 考察了pH 214范围内目标物的回收率。结果表明，大多数目标物在pH=8时有较高回收率。一般情况下，水相离子强度增加会降低目标物在水中的溶解度，从而提高萃取效率。实验考察了NaCl浓度在015%（w/V）范围内对目标物回收率的影响，结果表明不同浓度NaCl对生物碱的萃取效率影响较大，对鼠药的萃取效率影响不明显。这可能是由于鼠药在氯仿中溶解度较大，在萃取过程中鼠药受水相盐浓度的影响较小。因此，选择pH=8，N

9、aCl浓度为5%（w/V）的条件对目标物进行萃取。3.2 方法学考察 3.2.1 方法的线性关系与检出限、定量限 取空白液态样品1 mL，米饭样品1 g，将储备液（浓度见表1）用甲醇稀释1， 2， 5， 10， 20倍后加入样品中，每一浓度5份，再按2.2节对样品进行提取，在优化的色谱-质谱条件下，对目标物进行分析。考察了方法的线性范围、检出限（LOD， S/N=3）和定量限（LOQ， S/N=10），结果见表2。表明本方法灵敏度远低于各目标物的中毒剂量，可用于疑似鼠药或生物碱中毒症状的快速筛查。3.2.2 方法的回收率与精密度 取空白样品，准确加入适量的混合标准溶液，按照2.2节进行提取，在

10、相同的色谱-质谱条件下平行测定3次，计算回收率和精密度（表3）。结果表明，目标化合物在不同基质中加标回收率为81.0%110%。图2为标准溶液、尿液、黄酒、米饭加标后的典型色谱图。研究结果表明，本方法可快速测定食物中毒样品中3种鼠药（毒鼠强、溴鼠灵、溴敌隆）和5种有毒生物碱（莨菪碱、东莨菪碱碱、钩吻碱、士的宁、马钱子碱）。与传统萃取方法相比，DLLME具有所需样品量少，萃取时间短，操作简单、快速的特点，适用于中毒事件和法医毒物分析中鼠药和生物碱中毒的快速分析。References 1 CAI Xue-Ying， MENG Bo， YANG Bing. Beijing J. Tradit. Ch

11、in. Med.， 2006， 25（3）： 171-172 蔡雪映， 孟 礴， 杨 冰. 北京中医， 2006， 25（3） ：2 Li J， Jiang Y. Biomed. Chromatogr.， 2010， 24（2）： 186 3 Yu Z H， Wu Z P， Gong F J， Wong R， Liang C， Zhang Y R， Yu Y Q. J. Sep. Sci.， 2012， 35（20）： 2773-2780 4 Fourel I， Hugnet C， Goy-Thollot I， Berny P. J. Anal. Toxicol.， 2010， 34（2）：

12、95-102 5 ZHANG Chun-Hua， WU Hui-Qin， HUANG Xiao-Lan， ZHU Zhi-Xin， HUANG Fang， LIN Xiao-Shan， LUO Hui-Tai. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（6）： 862-869 张春华， 吴惠勤， 黄晓兰， 朱志鑫， 黄 芳， 林晓珊， 罗辉泰. 分析化学， 2012， 40（6）：6 WU Hui-Qin， ZHANG Chun-Hua， HUANG Xiao-Lan， ZHU Zhi-Xin， HUANG Fang， LIN Xiao-Shan， LUO Hui-Ta

13、i. Journal of Instrumental Analysis， 2013， 32（9）： 1031-1037 吴惠勤， 张春华， 黄晓兰， 朱志鑫， 黄 芳， 林晓珊， 罗辉泰. 分析测试学报， 2013， 32（9）：7 YAN Hui， SHEN Min. Fudan Univ. J. Med. Sci.， 2011， 38（4）： 361-366 严 慧， 沈 敏. 复旦大学报（医学版）， 2011， 38（4）：8 Dhalwal K， Shinde V M， Namdeo A G， Mahadlik K R， Kadam S S. J. Chromatogr. Sci.，

14、2007， 45： 706-709 9 WANG Xue Hu， YUAN Min， ZHANG Qian-Shang， ZHAO Wu-Sheng， GU Yue-Bao. Physical Testing and Chemical Analysis（Part B： Chemical Analysis）， 2011， 47（4）： 427-432 王学虎， 袁 敏， 张前上， 赵武生， 顾月保. 理化检验（化学分册）， 2011， 47（4）：10 ZHANG Rui， LEI Ning-Sheng， LIN Ying， SHU Xiao-Chuan. Guangxi J. Med.， 2012， 19（3）： 239-243 张 瑞， 雷宁生， 林 莹， 苏小川. 广西医学， 2012， 19（3