大肠菌检测-科立得酶底物法介绍PPT文件格式下载.ppt

1、耐热大肠菌群（粪大肠菌群耐热大肠菌群（粪大肠菌群，Fecal Coliforms）用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。是水体受人畜粪便污染的比较直接指标。大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌（大肠杆菌，E.Coli.）大肠埃希氏菌是指能产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide）使培

2、养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。大肠埃希氏菌是粪大肠菌群的组成部分，是水体受人畜粪便污染的最直接指标，水中含有大肠埃希氏菌提示有粪便污染。3相关背景信息相关背景信息大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌 耐热大肠菌群大肠埃希氏菌大肠菌群4背景材料检测方法背景材料检测方法多管发酵法多管发酵法（multiple tube fermentation,MTF）滤膜法滤膜法（membrane filtration,MF）酶底物法酶底物法（Minimum Media ONPG-MUG，简称MMO-MUG法，或Defined substrate technology，简称DST）5背景材料检测方法

3、背景材料检测方法多管发酵法多管发酵法（MTF）以100mL水样中大肠菌最可能数（most probable number,MPN）表示 培养基制备试管培养（2226小时）阴性结果（无产酸，产气）产酸，产气 平板培养1824小时 观察菌落形态，挑取特征菌落 革兰氏染色，镜检 证实试验（361培养箱中培养242h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在 6背景材料检测方法背景材料检测方法滤膜法滤膜法（membrane filtration,MF）用孔径为0.45的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数,计数单位为菌落形成单位CF

4、U（colony forming unit）储备培养基的制备过滤（需器械灭菌等）培养（22-24H）阴性结果（无典型菌落）观察菌落形态,挑取特征菌落 革兰氏染色，镜检 证实试验（361培养箱中培养242h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在 7背景材料检测方法背景材料检测方法酶底物法酶底物法原理原理：1，大肠菌群细菌能特异性产生-半乳糖苷酶（-D-galactosidase），该生物酶可以分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside，-半乳糖醛苷），使培养液呈黄色。2，大肠埃希氏菌能特异性产生-葡萄糖醛酸酶（-glucuronidase），分解MU

5、G（4-甲基-伞形葡萄糖苷酸，4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide）,使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光。利用该原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌。试试剂剂中中同同时时含含有有ONPGONPG和和MUGMUG，所所以以本本方方法法可可同同时时检检测测总总大大肠肠菌菌群群和和大大肠肠埃埃希希氏氏菌菌，51孔法并可以定量。孔法并可以定量。8检测方法酶底物法检测方法酶底物法（Enzyme Substrate Technique）国标国标GB/T 5750.12GB/T 5750.122006 2006 采用采用:DST 技术技术酶底物法酶底物法

6、1,方法方法 采用固定底物技采用固定底物技术（Defined Substrate Technology，DST）之之酶底物法，底物法，DST技技术 的原理就是采用和目的原理就是采用和目标细菌特异性反菌特异性反应的培养基的培养基,并使之量最小化并使之量最小化,比一般比一般酶底物法假阳底物法假阳 性性/阴性的阴性的发生率更底。生率更底。2 2，培养基：，培养基：采用采用Minimal Medium ONPG-MUG（MMO-MUG），即最少化，即最少化ONPG-MUG培养基培养基每1000mL MMO-MUG培养基所含基本成份为：A 硫酸铵 （NH4）2SO4 5.0gB 硫酸锰 Mn（SO4）2

7、 0.5mgC 硫酸锌 ZnSO4 0.5mgD 硫酸镁 MgSO4 100mgE 氯化钠 NaCl 10gF 氯化钙 CaCl2 50mgG 亚硫酸钠 Na2SO3 40mgH 两性霉素B Amphotericin B 1mgI Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside （ONPG）500mgJ 4-methyl-umbelliferyl-D-glucuronide （MUG）75mg K Solanium萃取物 500mgL N-2-Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethane sulphonic acid钠盐 5.3gM N-2-

8、Hydroxyethylpiperazine-N1-2-ethane sulphonic acid 6.9g9ONPG的阳性反应的阳性反应（总大肠菌群总大肠菌群Total Coliform之之阳性反应阳性反应）（Colilert and Colilert-18）10MUG的阳性反应的阳性反应（大肠杆菌大肠杆菌E.Coli阳性反应阳性反应）（Colilert,Colilert-18,Colisure）11Colilert唯一的酶底物法唯一的酶底物法（MMO-MUG）商品化产品商品化产品1987年上市，年上市，第一次收录在第一次收录在 Standard Methods 的第的第1818版版9223

9、9223部分部分,从从19-21版都收录在内。版都收录在内。世界卫生组织世界卫生组织,饮用水水质指南第三版饮用水水质指南第三版,2004.第第11.6.2部分部分 1989年首次通过美国年首次通过美国EPAEPA认证认证 在美国饮用水市场在美国饮用水市场,使用率大约使用率大约90%至今至今,七大洲都用此测试方式七大洲都用此测试方式目前唯一的酶底物法商品化产品（目前唯一的酶底物法商品化产品（MMO-MUG,DST）12Colilert之应用之应用饮用水饮用水 源水源水 瓶装水瓶装水 再生水再生水 废水废水 食品水食品水畜牧用水畜牧用水 医疗用水医疗用水 收录于收录于“标准测试法标准测试法”内内

10、APHA（美国公共卫生协会美国公共卫生协会）,US EPA,AOAC,US NCIMS,UK DWI,IBWA,WHO 13Colilert 实验及实验及调查调查 数据数据全世界有许多全世界有许多 Colilert 之相关资料之相关资料: Center For Disease Control 美国疾控中心 US EPA Information Collection Rule 美国 EPA资料收集法则（ICR）UK Drinking Water Inspectorate 英国饮用水监测（DWI）Frances Institute Pasteur 法国巴斯德学会拥有多项全球性的认证/专利IDEXX

11、 执照许可14Colilert（酶底物法酶底物法;MMO-MUG;DST）介绍介绍一个样品同时检测大肠菌群及一个样品同时检测大肠菌群及大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌24小时判断结果小时判断结果定性法或定量法定性法或定量法 （5151孔定量盘）孔定量盘）根据根据Defined Substrate TechnologyDefined Substrate Technology（DST）测量技术测量技术15Colilert（MMO-MUG,DST）针对目标细菌针对目标细菌（Coliforms&E.Coli）的特异性的特异性 营养指示剂营养指示剂（培养基培养基）营养指示剂作用时营养指示剂作用时,颜色会改变或呈

12、现萤光反应颜色会改变或呈现萤光反应其它非目标细菌不会干扰其它非目标细菌不会干扰 16减少杂菌干扰减少杂菌干扰无培养基干扰无培养基干扰（传统方式常会因消毒剂、盐、传统方式常会因消毒剂、盐、抗生素、毒素、温度造成抑制反应抗生素、毒素、温度造成抑制反应）减少假阳性反应减少假阳性反应减少假阴性反应减少假阴性反应 不须确认不须确认 特异性特异性 -大大肠菌群和肠菌群和大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌测试结果快速测试结果快速 判读容易判读容易优点优点m-endo MF*MTF*MLSB MF*Colilert*0%5%10%15%20%25%30%35%40%*Jacobs et al,AEM,1986.*Fri

13、cker et al,Water Res.,1997假阳性比较表假阳性比较表假阴性比较表假阴性比较表 17成本比较表成本比较表测试时间比较表测试时间比较表18定性检测操作示范定性检测操作示范 加入加入ColilertColilert试剂，试剂，摇晃至溶解摇晃至溶解 3636培养培养2424小时，判断结果小时，判断结果:1,1,无颜色变化阴性无颜色变化阴性 2,2,黄色大肠杆菌群阳性黄色大肠杆菌群阳性 3 3,黄色且荧光大肠埃希氏菌阳性黄色且荧光大肠埃希氏菌阳性4444.5.5培养培养24小小时，判断，判断结果：果：1,无无颜色色变化阴性化阴性 2,黄色黄色粪大大肠阳性阳性 195151孔法定量

14、检测操作示范孔法定量检测操作示范 加入加入ColilertColilert试剂后，试剂后，摇晃至溶解摇晃至溶解 将将ColilertColilert溶液倒入溶液倒入5151孔定量盘孔定量盘Quanti-Tray内内20Quanti-Tray定量盘操作示范定量盘操作示范 将定量盘将定量盘Quanti-Tray放入放入程控定量封口机程控定量封口机SealerSealer封口封口3636培养培养2424小时后，计算呈阳性小时后，计算呈阳性反应的格子，然后对照反应的格子，然后对照MPNMPN表表 计数计数（44.544.5培养培养2424小时用于检测粪大肠）小时用于检测粪大肠）27传统用法的步骤传统用

15、法的步骤 vs.Colilert28IDEXX 于于19841984年成立于美国缅因州，年营业额为年成立于美国缅因州，年营业额为7亿美元亿美元,在美国纳在美国纳斯达克斯达克上市上市全球有超过全球有超过3，000名员工名员工,400400多种的产品行销于多种的产品行销于70以上个国家以上个国家IDEXX 有庞大的研发团队并有有庞大的研发团队并有40-5040-50位具有专业执照的博士位具有专业执照的博士致力于简易、快速、精准具经济效益之测试产品致力于简易、快速、精准具经济效益之测试产品研发研发检测及诊断试剂和相关设备的全球市场领导者检测及诊断试剂和相关设备的全球市场领导者水质水质食品食品 宠物及经济动物宠物及经济动物爱德士爱德士 公司公司（IDEXX）简介简介29爱德士水质检测试剂爱德士水质检测试剂全球超过全球超过6,500家客户家客户,分散于世界各地超过分散于世界各地超过60多多个国家个国家 每年每年15-20%成长率成长率 ColilertColilert有全球有超过有全球有超过2020个以上的国家个以上的国家（地区地区）认证认证:美国美国 加拿大加拿大 英国英国 德国德国 法国法国 荷兰荷兰 西班牙西班牙 挪威挪威 匈牙利匈牙利 澳洲澳洲 纽西兰纽西兰 日本日本 韩国韩国 台湾台湾 马来西亚马来西亚 菲律宾菲律宾 约旦约旦 中国中国 巴西巴西 阿根廷阿根廷 墨