年实验一差异分离mRNAPPT文档格式.ppt

1、本课程内容：1 1、了解生殖细胞发生及受精过程。、了解生殖细胞发生及受精过程。2 2、观察胚胎发育的整体形态变化。、观察胚胎发育的整体形态变化。、分离、分离发育过程中特异基因片段发育过程中特异基因片段、检测特异基因的、检测特异基因的mRNAmRNA和蛋白质和蛋白质在发育过程中的表达在发育过程中的表达目的：、从整体形态结构、细胞、组织和分子四个水平目的：、从整体形态结构、细胞、组织和分子四个水平上综合了解动物发育过程及分子机制。上综合了解动物发育过程及分子机制。、学习掌握科学研究的思维方法和研究方法。实验目的：本实验材料以斑马鱼为主，并阔展到两栖类和哺乳类本实验材料以斑马鱼为主，并阔展到两栖类和

2、哺乳类本实验材料以斑马鱼为主，并阔展到两栖类和哺乳类本实验材料以斑马鱼为主，并阔展到两栖类和哺乳类一、观察斑马鱼卵母细胞和早期胚胎发育过程中一、观察斑马鱼卵母细胞和早期胚胎发育过程中一、观察斑马鱼卵母细胞和早期胚胎发育过程中一、观察斑马鱼卵母细胞和早期胚胎发育过程中不同时期形态、细胞、组织、器官形成的特点；不同时期形态、细胞、组织、器官形成的特点；二、分离鱼受精卵与神经胚特异基因表达基因片段；三、检测胚胎发育过程中的蛋白质表达。从形态结构、细胞、组织、分子四个水平上从形态结构、细胞、组织、分子四个水平上综合了解动物胚胎发育过程及分子机制。综合了解动物胚胎发育过程及分子机制。实验内容：主要材料（

3、斑马鱼、泥鳅和小鼠）主要材料（斑马鱼、泥鳅和小鼠）精子精子精子精子 生殖细胞发生过程生殖细胞发生过程生殖细胞发生过程生殖细胞发生过程 受精过程受精过程受精过程受精过程 受精卵受精卵受精卵受精卵 早期发育过程早期发育过程早期发育过程早期发育过程 个体个体个体个体 卵子卵子卵子卵子 第一部第一部第一部第一部分分分分 第二部第二部第二部第二部分分分分 第三部第三部第三部第三部分分分分 第一部分第一部分 （生殖细胞发生过程（生殖细胞发生过程 ）利用冰冻切片，组织学染色、利用冰冻切片，组织学染色、显微观察、比较哺乳动物和鱼显微观察、比较哺乳动物和鱼的生殖细胞发生过程中组织学的生殖细胞发生过程中组织学特点

4、。特点。第二部分第二部分 （受精过程）（受精过程）方法：人工催情、授精。方法：使学生能掌握鱼的人工授精和使学生能掌握鱼的人工授精和 小鼠超数排卵技术。小鼠超数排卵技术。第三部分第三部分 （早期发育过程）（早期发育过程）（早期发育过程）（早期发育过程）1 1、通过多媒体演示，通过多媒体演示，通过多媒体演示，通过多媒体演示，跟踪胚胎发育的活体观察跟踪胚胎发育的活体观察跟踪胚胎发育的活体观察跟踪胚胎发育的活体观察 ，了解鱼胚胎发，了解鱼胚胎发，了解鱼胚胎发，了解鱼胚胎发 育过程中不同时期的外形变化的特点。育过程中不同时期的外形变化的特点。2 2 2 2、通过多媒体演示，动物胚胎发育模型，采用石蜡切片

5、、通过多媒体演示，动物胚胎发育模型，采用石蜡切片、通过多媒体演示，动物胚胎发育模型，采用石蜡切片、通过多媒体演示，动物胚胎发育模型，采用石蜡切片 技术，了解鱼和蛙胚胎发育过程中不同时期组织发生技术，了解鱼和蛙胚胎发育过程中不同时期组织发生技术，了解鱼和蛙胚胎发育过程中不同时期组织发生技术，了解鱼和蛙胚胎发育过程中不同时期组织发生 变化的特点。变化的特点。3 3 3 3、采用差异显示技术，分离斑马鱼受精卵与原肠胚差异、采用差异显示技术，分离斑马鱼受精卵与原肠胚差异、采用差异显示技术，分离斑马鱼受精卵与原肠胚差异、采用差异显示技术，分离斑马鱼受精卵与原肠胚差异 基因表达的片段；克隆发育过程中特异表

6、达基因基因表达的片段；克隆发育过程中特异表达基因4 4 4 4、采用石蜡切片和蛋白质原位杂交技术，检测肌动蛋白、采用石蜡切片和蛋白质原位杂交技术，检测肌动蛋白、采用石蜡切片和蛋白质原位杂交技术，检测肌动蛋白、采用石蜡切片和蛋白质原位杂交技术，检测肌动蛋白 质在胚胎发育过程中的表达。质在胚胎发育过程中的表达。实验成绩考评实验成绩考评1 1、结果、结果 （考查最后结果）（考查最后结果）60%60%2 2、实验操作、考勤、实验操作、考勤 实验记录等实验记录等 5%5%3 3、综合、综合 卫生、卫生、5%5%4 4、实验报告、实验报告 25%25%5 5、预习、实验中原理的讲解（老师根据实验、预习、实

7、验中原理的讲解（老师根据实验 中的内容，提出许多问题，学生查资料，中的内容，提出许多问题，学生查资料，在实验空余时间以在实验空余时间以PPTPPT讲解讲解）5%）5%实验一实验一一、差异显示法分离斑马鱼卵巢和肝脏一、差异显示法分离斑马鱼卵巢和肝脏特异表达的基因片段特异表达的基因片段二、克隆发育过程中特异表达的基因二、克隆发育过程中特异表达的基因 片段。片段。一、实验原理利用真核基因利用真核基因mRNAmRNA的的33端端poly（Apoly（A）尾设计尾设计 oligodToligodT1212MNMN的锚定引物的锚定引物,mRNA 5_ AAAAAAAAAAAA.3cDNA 3_ C TTT

8、TTTTTTT.5cDNA 3_ A C TTTTTTTT.5cDNA 3_ G G TTTTTTTT.5cDNA 3_ T A TTTTTTTT.5 1 1、将不同组织器官、将不同组织器官 mRNAmRNA反转录合成反转录合成相应的单链相应的单链cDNAcDNA.2 2、以单链、以单链cDNAcDNA为模板为模板,用上述用上述33锚定引锚定引 物（物（oligodToligodT1212GC）GC）和和10bp10bp的的55随机随机引物进行引物进行PCRPCR扩增扩增 3 3、用变性聚丙烯酰胺胶电泳分离、用变性聚丙烯酰胺胶电泳分离PCRPCR产产物进行银染显色物进行银染显色.4 4、回收差

9、异条带经、回收差异条带经PCRPCR扩增后进行后续扩增后进行后续分析分析二、提取二、提取RNARNA1 1 1 1、每人称取、每人称取、每人称取、每人称取50mg50mg50mg50mg卵巢或肝脏放入卵巢或肝脏放入卵巢或肝脏放入卵巢或肝脏放入匀浆器匀浆器匀浆器匀浆器中中中中.加入加入加入加入1ml 1ml 1ml 1ml 反应液，彻底匀浆至清亮后，移入反应液，彻底匀浆至清亮后，移入反应液，彻底匀浆至清亮后，移入反应液，彻底匀浆至清亮后，移入1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml的的的的EPEPEPEP管管管管 中，冰上静置中，冰上静置中，冰上静置中，冰上静置5min5min5min5min；

10、2 2 2 2、加入、加入、加入、加入200ul200ul200ul200ul的的的的氯仿氯仿氯仿氯仿，颠倒混匀，冰上静置，颠倒混匀，冰上静置，颠倒混匀，冰上静置，颠倒混匀，冰上静置5min5min5min5min，12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm高速离心高速离心高速离心高速离心10101010分钟；分钟；3 3 3 3、小心将上层水相移至、小心将上层水相移至、小心将上层水相移至、小心将上层水相移至1.5mlEP1.5mlEP1.5mlEP1.5mlEP管中，加入管中，加入管中，加入管中，加入0.50.50.50.5体积体积体积体积 （200ul200ul200

11、ul200ul）酸性酚和）酸性酚和）酸性酚和）酸性酚和0.50.50.50.5体积（体积（体积（体积（200ul200ul200ul200ul）氯仿，颠）氯仿，颠）氯仿，颠）氯仿，颠 倒混匀，冰上静置倒混匀，冰上静置倒混匀，冰上静置倒混匀，冰上静置5min5min5min5min，12000rpm12000rpm12000rpm12000rpm离心离心离心离心10101010分钟；4 4、小心将上层水相移至、小心将上层水相移至1.5mlEP1.5mlEP管中，加入管中，加入 200ul200ul氯仿，颠倒混匀，冰上静置氯仿，颠倒混匀，冰上静置5min5min，12000rpm12000rpm离

12、心离心1010分钟；5 5、小心将上层水相移至、小心将上层水相移至1.5mlEP1.5mlEP管中，加入管中，加入 500ul500ul的的异丙醇异丙醇，颠倒混匀，冰上静置，颠倒混匀，冰上静置 5min5min，12000rpm12000rpm离心离心10min10min，小心弃上，小心弃上 清；清；6 6、加入、加入1ml75%1ml75%乙醇漂洗沉淀，高速离心乙醇漂洗沉淀，高速离心 12000rpm12000rpm，5min5min，小心弃上清；室温，小心弃上清；室温 静置干燥静置干燥1515分钟，分钟，7 7、加、加24.5ul 24.5ul DEPCDEPC处理的处理的水溶解水溶解RN

13、ARNA，同时加入同时加入 0.5ul 0.5ul RNasinRNasin（50u/ul）50u/ul）防止防止RNARNA降解；降解；8 8、取、取3ul RNA（3ul RNA（加加1ul1ul溴酚兰溴酚兰）用用1%1%琼脂糖电泳鉴琼脂糖电泳鉴 定定RNARNA的质量，是否有染色体的质量，是否有染色体DNADNA污染。污染。*结果找老师登记（结果找老师登记（记成绩）记成绩）三、三、RNARNA逆转录为逆转录为cDNAcDNA（25ul）（25ul）1 1 1 1、取、取、取、取5ulRNA5ulRNA5ulRNA5ulRNA，加入加入加入加入1ul 1ul 1ul 1ul oligool

14、igooligooligo dT dT dT dT12121212GC（10mM）（GC（10mM）（GC（10mM）（GC（10mM）（RTRTRTRT专专专专 用用用用），），），），混合后，混合后，混合后，混合后，70 70 70 70 变性变性变性变性5min5min5min5min，迅速置于迅速置于迅速置于迅速置于 冰上冰上冰上冰上minminminmin.2 2 2 2、再分别加入如下试剂：、再分别加入如下试剂：5 5 5 5M M M MMLV Reaction Buffer 5ulMLV Reaction Buffer 5ulMLV Reaction Buffer 5ulMLV Reaction Buffer 5ul 50U/ul 50U/ul 50U/ul 50U/ul RNAsinRNAsinRNAsinRNAsin（RibonucleaseRibonucleaseRibonucleaseRibonuclease Inhibitor）Inhibitor）Inhibitor）Inhibitor）0.