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1、、学习酶蛋白分离提纯的原理；3 5、学习掌握酶的比活力测定及其计算方法；、学习掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、运运用用正正交交试试验验法法确确定定温温度度、pH值值、离离子子浓浓度的最适条件度的最适条件；7、学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测、学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测 定定Km 的方法；的方法；8、学习掌握、学习掌握SDS-PAGE电泳原理和操作技术电泳原理和操作技术4 二、实验对象二、实验对象 啤酒酵母蔗糖酶啤酒酵母蔗糖酶 蔗糖酶蔗糖酶 是一种古老的酶，主要存在于酵母中，如啤是一种古老的酶，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母、曲霉、青霉等霉菌和细菌中，工酒酵母、面包酵母

2、、曲霉、青霉等霉菌和细菌中，工业上通常从酵母中制取；业上通常从酵母中制取；蔗糖酶在食品工业中，常用来转化蔗糖增加甜味，制蔗糖酶在食品工业中，常用来转化蔗糖增加甜味，制造人造蜂蜜，还用来制造果糖和巧克力的软心糖等。造人造蜂蜜，还用来制造果糖和巧克力的软心糖等。5 该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧；该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧；在细胞膜外细胞壁中的称之为在细胞膜外细胞壁中的称之为膜外蔗糖酶膜外蔗糖酶（external yeast invertase）,其活力占总酶活力的大部分，是含其活力占总酶活力的大部分，是含有有50%糖成分的糖蛋白；糖成分的糖蛋白；在细胞膜内侧细胞质中的

3、称之为在细胞膜内侧细胞质中的称之为膜内蔗糖酶膜内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖；，含有少量的糖；6 这两种酶组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性这两种酶组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，故本实验未区分膜内酶与膜外酶。质仍十分相似，故本实验未区分膜内酶与膜外酶。名称名称 MW亚基亚基Km（底物为蔗糖底物为蔗糖）pI（等电点等电点）最适最适pH最适温度最适温度膜外酶膜外酶27万万（22万万）双双26mM5.04.9（3.55.5）60膜内酶膜内酶13.5万万双双25mM4.54.5（3.55.5）607 三、实验步骤及原理三

4、、实验步骤及原理1、蔗糖酶的提取蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的纯化、蔗糖酶的纯化3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定、各纯化级别蔗糖酶的活性测定 4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定 5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响6、蔗糖酶酶促反应动力学研究、蔗糖酶酶促反应动力学研究7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量81、蔗糖酶的提取蔗糖酶的提取（细胞破壁细胞破壁）9基本特征：基本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。酵母菌细胞壁具三层结构酵母菌细胞壁具三层结构外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，都外层为甘露聚

5、糖，内层为葡聚糖，都是复杂的分枝状聚合物，其间夹有一层蛋白质分子。是复杂的分枝状聚合物，其间夹有一层蛋白质分子。酵母菌酵母菌10细胞破壁的方法细胞破壁的方法（1）高速组织捣碎）高速组织捣碎（2）玻璃匀浆器匀浆）玻璃匀浆器匀浆（3）超声波处理法）超声波处理法（4）反复冻融法反复冻融法（5）化学处理法）化学处理法（6）溶胞作用）溶胞作用（酶溶解法酶溶解法）（7）自溶法）自溶法11（1）高速组织捣碎）高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步

6、加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。所需速度。（2）玻璃匀浆器匀浆）玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。捣碎机高，适用于少量组织和脏器。12（3）超声波处理法：）超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常选用浓度为裂，此法多适用于微生物材料，常选用浓度为 50-100 毫克毫克

7、/毫升菌体，在毫升菌体，在 30 至至 60Hz 频率下处理频率下处理 10-15 分钟，此法的缺分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（4）反复冻融法：反复冻融法：将细胞在将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。胞结构破碎。13（5）化学处理法：）化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠钠（SDS

8、）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。（6）溶胞作用）溶胞作用（酶溶解法酶溶解法）：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、溶酶有溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。葡聚糖酶、蛋白酶等。（7）自溶法（本实验）：）自溶法（本实验）：将新鲜的生物材料存放于一定的将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。14干酵母

9、粉干酵母粉溶于蒸馏水溶于蒸馏水乙酸钠乙酸钠乙酸乙酯乙酸乙酯35恒温恒温搅拌搅拌40分钟分钟35恒温过夜恒温过夜本实验本实验采用自溶法进行破壁采用自溶法进行破壁补加蒸馏水补加蒸馏水搅拌均匀，成糊状搅拌均匀，成糊状离心离心弃沉淀及脂层弃沉淀及脂层E1 记录生产厂家和批号记录生产厂家和批号 用硫酸纸封严（过夜）用硫酸纸封严（过夜）152、蔗糖酶的纯化、蔗糖酶的纯化（1）有机溶剂分级沉淀）有机溶剂分级沉淀（2）透析）透析（3）离子交换层析）离子交换层析（4）凝胶层析）凝胶层析16E1用稀用稀 HAC 调调 pH乙醇分级乙醇分级（32%乙醇饱和度乙醇饱和度）离心离心，取上清取上清乙醇分级乙醇分级（47.

10、5%乙醇饱和度乙醇饱和度）离心离心，取沉淀取沉淀透析透析水水磷酸缓冲液过夜磷酸缓冲液过夜离心离心，取上清取上清E2E2E3DEAE52离子交换层析离子交换层析E3E4Sephadex-G100 凝胶层析凝胶层析17酶酶的蛋白属性的蛋白属性两性电离两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH 条件下都可解离条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。成带负电荷或正电荷的基团。等电点等电点（isoelectric point,pI）当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时

11、，蛋蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷荷为为零零，此此时时溶液的溶液的 pH 称为蛋白质的等电点称为蛋白质的等电点。18 大分子大分子（胶体胶体）分子量可自分子量可自1 万至万至100 万之巨，其分子的直径万之巨，其分子的直径可达可达 1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。稳定的因素稳定的因素l 颗粒表面电荷颗粒表面电荷l 水化膜水化膜19+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜酸碱酸碱+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质

12、的聚沉20（1 1）有机溶剂分级沉淀）有机溶剂分级沉淀）有机溶剂分级沉淀）有机溶剂分级沉淀 向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。l亲亲水水性性有有机机溶溶剂剂加加入入溶溶液液后后降降低低介介质质的的介介电电常常数数，使使溶溶质质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。l亲亲水水性性有有机机溶溶剂剂的的水水合合作作用用降降低低了了自自由由水水的的浓浓度度，压压缩缩了了表面水化膜的厚度表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。，

13、降低其亲水性，导致脱水凝集。l乙醇、丙酮是最常用的沉淀溶剂。乙醇、丙酮是最常用的沉淀溶剂。21 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 l 溶剂选择溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。l 温度温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行

14、。l 样品浓度的控制样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2%为好，粘多糖则为好，粘多糖则以以1%-2%较合适。较合适。22（2）透析透析 利用具有一定孔径的亲水膜，利用具有一定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物在常压下依靠小分子物质的扩散运动，质的扩散运动，将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法或缓冲溶液分隔的一种方法.透析的透析的动力动力是由膜两边的浓度梯度形成是由膜两边的浓度梯度形成扩散压扩散压。其速。其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。常用温度：度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。4。保

15、留在透析袋内未透析出的样品溶液称为保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液保留液”，袋（膜）外的溶液称为，袋（膜）外的溶液称为“渗出液渗出液”或或“透析液透析液”。23 新透析袋可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗新透析袋可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净。使用时，一端用橡皮筋或透析袋夹扎紧，由另一净。使用时，一端用橡皮筋或透析袋夹扎紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留析液，通常要留 1/3-1/2 的空间，以防透析过程中，的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。袋内将袋涨破。l 用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。l 用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩浓缩。保存：0.05%-0.1