基因结构及功能分析PPT资料.ppt

1、因因此此，一一个个样样品品的的4个个反反应应产产物物可可在在同同一一个个泳泳道内电泳。道内电泳。2.单色荧光法：单色荧光法：采采用用单单一一荧荧光光染染料料标标记记引引物物5-端端或或dNTP，所所有有产产物物的的5-末末端端均均带带上上了了同同一一种种荧荧光光标标记记，一一个个样样品品的的四四个个反反应应必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳必须分别进行，相应产物也必须在四个不同的泳道内电泳目录目录（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷（三）焦磷酸测序是一种基于发光法测定焦磷酸的测序技术酸的测序技术 焦焦磷磷酸酸测测序序技技术术操操作作简简单单，结结果果准准确确可可靠靠，可可应

2、应用用于于单单核核苷苷酸酸多多态态性性位位点点（SNP）分分析析、等等位位基基因因频频率率测测定定、细细菌菌和和病病毒毒等等微微生生物物的的分分型型鉴鉴定定、CpG甲甲基基化化分分析析、扫扫描描与与疾疾病病相相关关基基因因序序列列中中的的突突变变点点等等领领域域。该该方方法法的的测测序序长长度度一一般般短短于于Sanger法。法。目录目录（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术 循环芯片测序（循环芯片测序（cyclic-array sequencing）可实现大规模并行化分析可实现大规模并行化分析 不需电泳，设备易于微型化不需电泳，设备易于微型化 样本和试剂

3、的消耗量降低，降低了测序成本样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本 优势：优势：技术平台：454测序、测序、Solexa测序（测序（Illumina测序）、测序）、SOLiD测序等。测序等。目录目录基本流程：基本流程：将基因组将基因组DNA随机切割成为小片段随机切割成为小片段DNA；在所获小片段在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然分子的末端连上接头，然后变性得到单链模板文库；后变性得到单链模板文库；将带接头的单链小片段将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体文库固定于固体表面；表面；对固定片段进行克隆扩增，从而制成对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。芯片。针对芯片上的针对芯片

4、上的DNA，利用聚合酶或连接酶进，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。碱基序列。目录目录（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术 主要策略：主要策略：通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（子测序，如单分子实时技术（single molecule real time technology，SMRT）；）；利用利用DNA聚合酶在聚合酶在DNA合成时的

5、天然化学方式合成时的天然化学方式来实现单分子测序；来实现单分子测序；直接读取单分子直接读取单分子DNA序列信息。序列信息。目录目录二、基因转录起点分析技术二、基因转录起点分析技术 转录起点（转录起点（transcription start site，TSS）（一）用（一）用cDNA克隆直接测序法鉴定克隆直接测序法鉴定TSS 以以mRNA为模板，经逆转录合成为模板，经逆转录合成cDNA第一链，同时第一链，同时利用逆转录酶的末端转移酶活性，在利用逆转录酶的末端转移酶活性，在cDNA第一链的末端第一链的末端加上加上polyC尾，并以此引导合成尾，并以此引导合成cDNA第二链。将双链第二链。将双链cD

6、NA克隆于适宜载体，通过对克隆克隆于适宜载体，通过对克隆cDNA的的5-末端进行末端进行测序分析即可确定基因的测序分析即可确定基因的TSS序列。序列。该方法比较简单，尤其适于对特定基因该方法比较简单，尤其适于对特定基因TSS的分析。的分析。但可导致但可导致5-末端部分缺失，从而影响对末端部分缺失，从而影响对TSS的序列测定。的序列测定。目录目录（二）用（二）用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定末端快速扩增技术鉴定TSS 常用的技术包括常用的技术包括5-末端基因表达系列分析（末端基因表达系列分析（5-end serial analysis of gene expression，5-SAGE）和帽分

7、析基因表达）和帽分析基因表达（cap analysis gene expression，CAGE）技术。）技术。目录目录（三）用数据库搜索（三）用数据库搜索TSS 利用对寡核苷酸帽法构建的全长利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文文库库5-末端测序所得的数据信息建立了一个末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库（数据库（database of transcription start sites，DBTSS），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现了一次测试可产生测序法，从

8、而实现了一次测试可产生1107 个个TSS的数据。的数据。目录目录三、基因启动子结构分析技术三、基因启动子结构分析技术（一）用（一）用PCR结合测序技术分析启动子结构结合测序技术分析启动子结构 该方法最为简单和直接，即根据基因的启动该方法最为简单和直接，即根据基因的启动子序列，设计一对引物，然后以子序列，设计一对引物，然后以PCR法扩增启动法扩增启动子，经测序分析启动子序列结构。子，经测序分析启动子序列结构。目录目录（二）用核酸（二）用核酸-蛋白质相互作用技术分析启动蛋白质相互作用技术分析启动子结构子结构 1.用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点用足迹法分析启动子中潜在的调节蛋白结合位点

9、 足迹法（足迹法（footprinting）是利用）是利用DNA电泳条带电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域，它是研究核酸区域，它是研究核酸-蛋白质相互作用的方法，而蛋白质相互作用的方法，而不是专门用于研究启动子结构的方法。不是专门用于研究启动子结构的方法。分类：酶足迹法酶足迹法化学足迹法化学足迹法 目录目录（1）用核酸酶进行足迹分析）用核酸酶进行足迹分析 酶酶足足迹迹法法（enzymatic footprinting）是是 利利 用用DNA酶酶处处理理DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物，然然后后通通过过电电泳泳分分析蛋白质结合序列。析蛋

10、白质结合序列。常常用用的的酶酶有有DNA酶酶I（DNase I）和和核核酸酸外外切切酶酶III。目录目录（2）用化学试剂进行足迹分析）用化学试剂进行足迹分析 化化学学足足迹迹法法（chemical footprinting）是是利利用用能能切切断断DNA骨骨架架的的化化学学试试剂剂处处理理DNA-蛋蛋白白质质复复合合物物，由由于于化化学学试试剂剂无无法法接接近近结结合合了了蛋蛋白白质质的的DNA区区域域，因因此此在在电电泳泳上上形形成成空空白白区区域域的的位位置置就就是是DNA结结合合蛋蛋白白的的结结合合位位点点。最最常常用用的的化化学学足足迹迹法法是是羟羟自自由由基基足足迹迹法法（hydro

11、xyl radical footprinting）。目录目录2.用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定用电泳迁移率变动分析和染色质免疫沉淀技术鉴定启动子启动子 电电泳泳迁迁移移率率变变动动分分析析（EMSA）和和染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀（ChIP）只只能能确确定定DNA序序列列中中含含有有核核蛋蛋白白结结合合位位点点，故故尚尚需需结结合合DNA足足迹迹实实验验和和DNA测测序序等技术来确定具体结合序列。等技术来确定具体结合序列。目录目录（三）用生物信息学预测启动子（三）用生物信息学预测启动子 1.用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子用启动子数据库和启动子预测算法定义启动子 在在定

12、定义义启启动动子子或或预预测测分分析析启启动动子子结结构构时时应应包包括括启启动子区域的动子区域的3个部分个部分 核心启动子（核心启动子（core promoter）；近近端端启启动动子子（proximal promoter）：含含有有几几个个调控元件的区域，其范围一般涉及调控元件的区域，其范围一般涉及TSS上游几百个碱基；上游几百个碱基；远远端端启启动动子子（distal promoter）：范范围围涉涉及及TSS上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。上游几千个碱基，含有增强子和沉默子等元件。目录目录2.预测启动子的其他结构特征预测启动子的其他结构特征 启启动动子子区区域域的的其其他他结

13、结构构特特征征包包括括GC含含量量、CpG比比率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。用用于于启启动动子子预预测测的的数数据据库库：EPD（eukaryotic promoter databases）数数据据库库，主主要要预预测测真真核核RNA聚聚合合酶酶型型启启动动子子，数数据据库库中中的的所所有有启启动动子子数数据据信信息息都都经经过过实实 验验 证证 实实；TRRD（transcription regulatory region databases）是是一一个个转转录录调调控控区区数数据据库库，数数据据来来源源于于已已发发表的科学论文。表的科学论文。目录目录四、基因编码序列分析技术四、基因编码序列分析技术（一）用（一）用cDNA文库法分析基因编码序列文库法分析基因编码序列 cDNA克克隆隆测测序序或或构构建建cDNA文文库库是是最最早早分分析析基基因因编编码码序序列列的的方方法法。全全长长cDNA文文库库可可以以通通过过mRNA的的结结构构特特征征进进行行判判断断，mRNA的的序序列列基基本本都都由由3部部分分组组成成，即即5-UTR、编码序列和、编码序列和3-UTR。cDNA末末端端快快速速扩扩增增（RACE）技技术术是是高高效效