赛恩斯医学硕士毕业论文答辩幻灯参考PPT文件格式下载.ppt

1、5、Genistein作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全脑缺血造成的神经元的延迟性死亡；一个单纯的氧诱脑缺血造成的神经元的延迟性死亡；一个单纯的氧诱导的脑缺血小鼠模型显示导的脑缺血小鼠模型显示Genistein具有抗氧化活性。具有抗氧化活性。6.eNOS活性的升高对脑中风具有有益作用。另研究发活性的升高对脑中风具有有益作用。另研究发现，现，Genistein能够诱导能够诱导eNOS活性并激活核因子活性并激活核因子NF-E2相关因子相关因子（Nrf2），进而诱导抗氧化酶表达、减少心血，进而诱导抗氧化酶表达、减少心血管疾病的发生。管疾病的发生。那么，那么，Ge

2、nistein postconditioning（GPC，即缺，即缺血后给予血后给予Genistein）是否能通过是否能通过eNOS/Nrf2/ARE信信号通路号通路降低氧化应激，从降低氧化应激，从而发挥抗缺血性神经元损而发挥抗缺血性神经元损伤的作用？目前尚未见报道。伤的作用？本研究采用四动脉结扎本研究采用四动脉结扎（4-VO）全脑缺血模型，全脑缺血模型，观察观察GPC对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论依据。依据。二、材料与方法二、材料与方法1.1.主要实验仪器和试剂主

3、要实验仪器和试剂大鼠脑立体定位仪大鼠脑微量注射泵冰冻切片机激光扫描共聚焦显微镜酶标仪电泳设备摇床Morris水迷宫超低温冰箱等组织裂解液BCA蛋白浓度测定试剂盒eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相应的二抗NBT/BCIP显色液 NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及对应的荧光二抗TUNEL试剂盒2.2.实验分组实验分组SPF级成年雄性级成年雄性SD大鼠大鼠随机分组及随机分组及4-VO模型模型ShamI/RVeh1（IR+DMSO）GPCVeh2（GPC+NaCl）L-NAME30m24hI10mI10mI10mI10mI10m30m6h1d5d椎动脉电凝并分离颈总动脉椎动脉电

4、凝并分离颈总动脉缺血缺血尾静脉注射尾静脉注射Genistein1mg/kg侧脑室注射侧脑室注射L-NAME1mg/5l0.9%NaCl0.1%DMSO3d7d9d3.3.技术路线图技术路线图再灌注再灌注5d检测检测海马海马CA1区神经元区神经元的凋亡及存活的凋亡及存活实验方法及检测指标实验方法及检测指标再灌注再灌注30min,6h,1d,3d 观察观察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表达蛋白表达免疫荧光免疫荧光染色法染色法蛋白免疫蛋白免疫印迹技术印迹技术TUNEL染色染色及及NeuN染色染色再灌注再灌注3d观察观察海马海马CA1区神区神经元经元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋

5、白的蛋白的表达及定位表达及定位 Morris水迷宫水迷宫再灌注再灌注7-9d，检测大鼠的空间检测大鼠的空间学习和记忆能力学习和记忆能力4.4.统计学分析统计学分析 数据整理后，应用数据整理后，应用SigmaStat3.5统计软件进行统统计软件进行统计学分析。所有计量资料数值以均数计学分析。所有计量资料数值以均数标准差表示，标准差表示，采用单因素方差分析采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法照组比较用最小显著差法（LSD），各实验组之间比较，各实验组之间比较采用采用q检验检验（Newman-keuls test），P 0.05为差异有统计为

6、差异有统计学意义。学意义。三、实验结果与讨论三、实验结果与讨论Genistein后处理是否具有神经保后处理是否具有神经保护作用呢？护作用呢？图图1 NeuNNeuN及及及及TUNELTUNEL免疫荧光染色观察再灌注免疫荧光染色观察再灌注免疫荧光染色观察再灌注免疫荧光染色观察再灌注5d5d大鼠海马大鼠海马大鼠海马大鼠海马CA1CA1区神经元的存活及凋亡区神经元的存活及凋亡区神经元的存活及凋亡区神经元的存活及凋亡图图A：NeuN（红色红色）染色染色：生存的神经元；：TUNEL（绿色绿色）染色：凋亡样神经元；图染色：图B：海马：海马CA1区区1mm 长度内长度内NeuN 阳性神经元数量统计图；图阳性

7、神经元数量统计图；图C：海马CA1区区1mm长度内长度内 TUNEL阳性阳性神经元数量统计图神经元数量统计图;*P0.05 vs.I/R 组，组，#P0.05 vs.GPC 组，组，n=5;40,bar=50mABC小结小结 1 Genistein后处理对缺血性神经元损伤具有保后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用，护作用，eNOS激酶抑制剂激酶抑制剂L-NAME减弱了该减弱了该作用，说明作用，说明eNOS可能参与了此保护作用。可能参与了此保护作用。Genistein后处理是否诱导后处理是否诱导eNOS激活（磷酸化）激活（磷酸化）?图图2 GPC对对大鼠海马大鼠海马大鼠海马大鼠海马CA1CA1区

8、神经元区神经元区神经元区神经元eNOS、p-eNOS蛋白表达的影响蛋白表达的影响图图A：再灌注不同时间点：再灌注不同时间点p-eNOS、eNOS蛋白的表达；蛋白的表达；Sh：Sham组；组；R：再灌注；I/R组；GPC组；GPC:Genistein后处理；图后处理；p-eNOS蛋白表达统计图：蛋白表达统计图：n=4；*p0.05 vs.I/R组组 AB图图3 L-NAME对再灌注对再灌注3d大鼠海马大鼠海马大鼠海马大鼠海马CA1CA1区神经元区神经元区神经元区神经元eNOS磷酸化水平的影响磷酸化水平的影响 图图A：各实验组再灌注：各实验组再灌注3 d p-eNOS蛋白表达；图蛋白表达；各实验组

9、再灌注3 d p-eNOS蛋白表达统计图，蛋白表达统计图，n=5，*p0.05 VS.I/R 组；#p0.05 VS.Vehicle2 组组AB小结小结 2Genistein后处理可诱导全脑缺血大鼠海马后处理可诱导全脑缺血大鼠海马CA1区区eNOS磷磷酸化水平升高，酸化水平升高，eNOS激酶抑制剂激酶抑制剂L-NAME可有效降低可有效降低GPC诱导的诱导的eNOS磷酸化水平。磷酸化水平。结果揭示：eNOS磷酸化水平升高参与了磷酸化水平升高参与了Genistein的神经的神经保护作用。保护作用。Genistein后处理是否能有效降低后处理是否能有效降低缺血再灌注后神经元的氧化应激损缺血再灌注后神

10、经元的氧化应激损伤呢伤呢?4-HNE是脂质过氧化的最终产物，被公认为氧化应激最稳定的标记物是脂质过氧化的最终产物，被公认为氧化应激最稳定的标记物 8-OHdG，是，是DNA氧化损伤的特异产物氧化损伤的特异产物 图图4 全脑缺血再灌注全脑缺血再灌注3 d，各实验组大鼠，各实验组大鼠海马海马海马海马CA1CA1区区区区4-HNE4-HNE及及及及8-OHdG8-OHdG免疫荧光染色免疫荧光染色免疫荧光染色免疫荧光染色GPCI/RABGPCI/R图图A：绿色：绿色:NeuN；红色红色:4-HNE；图图B：红色：红色:DAPI；绿色绿色:8-OHdG；n=4-5；40；bar=50 m小结小结 3 G

11、PC能有效降低氧化应激损伤；能有效降低氧化应激损伤；eNOS激酶激酶抑制剂抑制剂L-NAME废除了此神经保护作用。废除了此神经保护作用。Nrf2/ARE信号是生物体内抗氧化信号是生物体内抗氧化应激反应最重要的内源性防御系统。应激反应最重要的内源性防御系统。那么，那么，GPC是否通过是否通过eNOS诱导了诱导了此信号通路此信号通路?图图5 A-C GPC促进促进大鼠海马大鼠海马大鼠海马大鼠海马CA1CA1区区区区Nrf2Nrf2蛋白表达蛋白表达蛋白表达蛋白表达图图A：再灌注不同时间点核内：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达；再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白蛋白表达统计图，表达统计图，n=4，*

12、p0.05 vs.I/R组；图组；再灌注：再灌注3d 各实验组各实验组Nrf2 蛋白的表达及蛋白的表达及统计图；统计图；*p0.001 vs.I/R组，组，#p0.001 vs.Vehicle2 组组ACB图图5 D 免疫荧光染色法观察大鼠再灌注免疫荧光染色法观察大鼠再灌注免疫荧光染色法观察大鼠再灌注免疫荧光染色法观察大鼠再灌注3d3d海马海马海马海马CA1CA1区区区区神经元内神经元内神经元内神经元内Nrf2 Nrf2 的表达及定位的表达及定位的表达及定位的表达及定位绿色：Nrf2；红色；黄色：二者的共定位；bar=30m.L-NAME图图6 大鼠再灌注大鼠再灌注大鼠再灌注大鼠再灌注3d3d

13、海马海马海马海马CA1CA1区神经元内区神经元内区神经元内区神经元内HO-1HO-1蛋白表达蛋白表达蛋白表达蛋白表达及其与及其与及其与及其与Nrf2Nrf2的共定位的共定位的共定位的共定位B图图A-B：HO-1蛋白表达及其统计图；图蛋白表达及其统计图；HO-1与与Nrf2蛋白的共定位，蛋白的共定位，*p0.05 VS.I/R 组；#p0.05 VS.vehicle2组；HO-1；蓝色：；合成；合成图为三者的共定位；图为三者的共定位；bar=50m；CL-NAMEI/R ShamGPCVehicle2L-NAMEHO-1NeuNA小结小结 4 GPC可显著增加海马可显著增加海马CA1区神经元胞核

14、中区神经元胞核中Nrf2蛋白的表蛋白的表达并引起下游靶基因达并引起下游靶基因HO-1的表达，而的表达，而L-NAME阻断了此阻断了此作用。作用。此结果进一步揭示此结果进一步揭示GPC通过通过eNOS诱导了诱导了Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤。元损伤。海马是学习和记忆的重要部位，而海马是学习和记忆的重要部位，而海马海马CA1区是缺血最敏感的区域。区是缺血最敏感的区域。那么，那么，GPC是否能改善大鼠缺血是否能改善大鼠缺血后空间学习记忆能力后空间学习记忆能力?图图7 GPCGPC对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响图图A-B：潜伏实验和探索实验统计图