第五章细菌检验技术PPT推荐.pptx

1、免疫学技术、分子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。本章重点本章重点：革兰染色的原理、操作方法及意义 细菌培养及生长现象 细菌生化反应及临床应用第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术一、染色标本镜检一、染色标本镜检（一）染色标本检查的一般程序（一）染色标本检查的一般程序第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术1.单染色法 细菌标本经涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分钟，水洗后待玻片燥后即可镜检（二）常用的染色方法（二）常用的染色方法第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术（二）常用的染色方法（二）常用的染色方法 2.革兰染色法 【方法】第一节第一节 细菌形态检验技术细菌

2、形态检验技术（二）常用的染色方法（二）常用的染色方法 2.革兰染色法【结果】紫色革兰阳性菌（1000）红色革兰阴性菌（1000）第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术（二）常用的染色方法（二）常用的染色方法 3.抗酸染色法 【结果】抗酸染色结果（1000）：红色为抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术（三）其他染色法（三）其他染色法 1.特殊结构染色法 （1）荚膜染色法荚膜染色结果，1000第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术（三）其他染色法（三）其他染色法 1.特殊结构染色法 （2）鞭毛染色法鞭毛染色结果，1000第一节第一节 细菌形态检验

3、技术细菌形态检验技术（三）其他染色法（三）其他染色法 1.特殊结构染色法 （3）芽孢染色法芽孢染色结果，1000第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术（三）其他染色法（三）其他染色法1.特殊结构染色法 （4）异染颗粒染色法 异染颗粒亚甲蓝染色结果：白喉棒状杆菌，1000第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术（三）其他染色法（三）其他染色法 2.负染色法 墨汁荚膜染色（脑脊液中的新型隐球菌，400）第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术二、不染色标本镜检二、不染色标本镜检 1.压滴法 压滴法镜检结果：尿涂片，400第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术二、不染色标

4、本镜检二、不染色标本镜检 2.悬滴法 第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术二、不染色标本镜检二、不染色标本镜检 3.毛细管法 三、其他显微镜检查三、其他显微镜检查第一节第一节 细菌形态检验技术细菌形态检验技术第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术一、基本条件一、基本条件 接种环接种环培养皿培养皿红红外外接接种种灭灭菌菌器器培培 养养 箱箱生物安全柜生物安全柜第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术一、基本条件一、基本条件 培养基成份培养基成份培养基：人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。营养物质：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇类、血液、鸡蛋及动物血清、生长因子

5、、无机盐等水凝固剂：琼脂、明胶抑制剂：孔雀绿、煌绿、胆盐、抗生素等 指示剂：溴麝香草酚蓝，溴甲酚紫、酚红等 第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术基础培养基：普通琼脂平板营养培养基：满足营养需求较高细菌的生长，如血琼脂平板、巧克力琼脂平板等鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖铁培养基（KIA）及各种生化反应用培养基选择培养基：具有选择性抑制非目的菌生长作用，用于选择性培养目的菌，如SS平板、中国蓝琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板等增菌培养基：用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤、GN增菌肉汤特殊培养基：厌氧培养基、L型细

6、菌培养基培养基种类（按用途分）培养基种类（按用途分）培养基培养基第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术液液体体培培养养基基培养基的种类（按物理性状分类）培养基的种类（按物理性状分类）液 体 培 养 基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。半固体培养基：含0.20.5琼脂，用于观察细菌的动力。固 体 培 养 基：含2 3琼脂，用于细菌的分离培养。第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术培养基灭菌培养基灭菌基础培养基：基础培养基：121121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1515分钟

7、分钟 含糖培养基：含糖培养基：113 113 灭菌灭菌1515分钟分钟含鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌含鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3 3天天3 3次次不耐高温的液体成分：滤过除菌不耐高温的液体成分：滤过除菌调配调配溶化溶化调调PhPh过滤澄清过滤澄清分装分装灭菌灭菌检定检定保存保存培养基制备程序培养基制备程序 （一）无菌技术（一）无菌技术u细菌检验的操作应在无菌室或生物安全柜内进行u无菌室、生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌u细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理u标本的采集严格无菌操作u无菌试管、烧瓶的使用时注意管口灭菌第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术二、细菌接种与培养技术

8、二、细菌接种与培养技术 （二）细菌接种与分离技术（二）细菌接种与分离技术第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术灭菌接种环（针）冷却挑取标本（细菌）接种灭菌接种环（针）平板划线法分区划线连续划线 分区划线法分区划线法第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术连续划线法连续划线法第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术斜面接种半固体穿刺接种液体接种第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术（三）细菌培养方法（三）细菌培养方法一般培养（需氧培养

9、）：培养需氧或兼性厌氧菌培养温度：35 37 培养时间：1824小时二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等培养厌氧菌第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术三、细菌的生长现象第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术菌落与菌苔血平板上溶血现象细菌在液体培养基中生长现象第二节第二节 细菌接种与培养技术细菌接种与培养技术菌膜对照沉淀浑浊沿穿剌沿穿剌线扩散生散生长在穿剌在穿剌线上生上生长细菌在半固体培养基中的现象一、碳水化合物的代谢试验一、碳水化合物的代谢试验第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴定技术原理：多糖原

10、理：多糖单糖单糖丙酮酸丙酮酸酸性产酸性产物物（或产气或产气）pH pH 呈酸性变色呈酸性变色（或出现气泡或出现气泡）方法：方法：将待检细菌以无菌操作接种将待检细菌以无菌操作接种到糖发酵管中，置到糖发酵管中，置3535温箱培养温箱培养181824h24h，观察结果。，观察结果。1 1、糖（醇、苷）类发酵试验、糖（醇、苷）类发酵试验结 果一、碳水化合物的代谢试验一、碳水化合物的代谢试验第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴定技术原理：根据细菌在分解葡萄糖的代原理：根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧分子需求的不同，将谢过程中对氧分子需求的不同，将细菌分为氧化、发酵和产碱型三类细菌分为氧化、发酵和

11、产碱型三类 2 2、O/FO/F试验试验结 果方法：取方法：取2 2支支HLHL葡萄糖培养葡萄糖培养管煮沸驱氧，冷却后接种管煮沸驱氧，冷却后接种细菌。将其中一管敞开，细菌。将其中一管敞开，另一管用液体石蜡封管，另一管用液体石蜡封管，培养培养18 18 24h24h观察结果观察结果 3 3、甲基红试验、甲基红试验第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴定技术原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，进一步分解生成大量混合酸，酸，进一步分解生成大量混合酸，使培养使培养pHpH下降至下降至4.44.4以下，加入甲以下，加入甲基红后，呈现红色反应。为甲基红基红后，呈现红色反应。为

12、甲基红试验阳性。试验阳性。将待检菌种接种于葡萄糖蛋方法：将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水中白胨水中,35,35培养培养18241824小时后小时后,往往培养基中加入甲基红指示剂少许培养基中加入甲基红指示剂少许,观观察结果。察结果。结结 果果 4 4、V-PV-P试验试验第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴定技术原理：细菌分解葡萄原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境中，甲醇，在碱性环境中，乙酰甲基甲醇被氧化乙酰甲基甲醇被氧化为二乙酰，二乙酰与为二乙酰，二乙酰与胍基化合物结合，生胍基化合物结合，生成红色化合物，是为成红色化合物

13、，是为V-PV-P试验阳性。把待检细菌接种在葡萄糖蛋白方法：把待检细菌接种在葡萄糖蛋白胨水中，胨水中，3535培养培养1824h1824h后，按每毫后，按每毫升培养液加入升培养液加入0.1ml0.1ml含含2 2肌酸或肌酐肌酸或肌酐的的4040KOHKOH溶液溶液,数分钟或数小时后数分钟或数小时后观察结果。观察结果。结结 果果空白对照空白对照 阴性阴性 阳性阳性 5 5、-半乳糖苷酶试验（半乳糖苷酶试验（ONPGONPG）第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴定技术原理：有的细菌原理：有的细菌可产生可产生-半乳糖半乳糖苷酶，能分解邻苷酶，能分解邻硝基酚硝基酚-D-D半乳糖半乳糖苷苷（ONPG

14、）（ONPG）而生成而生成黄色的邻硝基苯黄色的邻硝基苯酚，该试验也称酚，该试验也称为为ONPGONPG试验试验。将被检制成菌悬液，加入方法：将被检制成菌悬液，加入1 1滴甲滴甲苯充分振摇，苯充分振摇，3737水浴水浴5 5 分钟，使酶释分钟，使酶释放，然后再加入放，然后再加入0.25ml ONPG0.25ml ONPG，混匀后，混匀后，置于置于3737水浴中温育，菌悬液呈黄色为水浴中温育，菌悬液呈黄色为阳性反应。阳性反应。结结 果果阴性阴性 阳性阳性 6 6、七叶苷水解试验七叶苷水解试验 第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴定技术原理：原理：某些细菌能分解七叶苷产生葡某些细菌能分解七叶苷产

15、生葡萄糖与七叶素，七叶素与培养基中的萄糖与七叶素，七叶素与培养基中的Fe2+Fe2+结合后，形成黑色的化合物，使结合后，形成黑色的化合物，使培养基变黑。培养基变黑。将待检细菌接方法：将待检细菌接种到七叶苷培养基上，种到七叶苷培养基上，培养后观察结果，培培养后观察结果，培养基变黑色者为阳性，养基变黑色者为阳性，培养基不变色为阴性。培养基不变色为阴性。结结 果果+-二、二、蛋白质和氨基酸的代谢蛋白质和氨基酸的代谢第三节第三节 细菌生化鉴定技术细菌生化鉴定技术原理：细菌产生色氨酸酶，分解原理：细菌产生色氨酸酶，分解培养基中色氨酸，生成靛基质培养基中色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与对二甲基氨（吲哚），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质，基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基质，是为靛基质试验阳性。是为靛基质试验阳性。将待检菌接种于蛋白胨水方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，中，3535培养