沈萍微生物原版PPT第6章PPT推荐.ppt

1、,第一节 微生物生长的测定,单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化,微生物生长：,（参见P146）,微生物生长的测定：,个体计数群体重量测定群体生理指标测定,评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；,评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的效果；,客观地反映微生物生长的规律；,第一节 微生物生长的测定,（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定,通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）,1、培养平板计数法,（参见P147）,采用培养平板计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果：,样品充分混匀；,每支移液

2、管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；,同一稀释度三个以上重复,取平均值；,每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；,一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。,（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定,2、膜过滤培养法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。,（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定,3、The most probable number method（液体稀释法）,主要适用于只能进

3、行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。,对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。,（一）以数量变化对微生物生长情况进行测定,4、显微镜直接计数法,（参见P147）,1）常规方法：,采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。,缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,（一）以数量变化对微生物生长情况进行测

4、定,4、显微镜直接计数法,（参见P147）,2）其它方法：,将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。,比例计数：,过滤计数：,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上（或一定面积中）的细菌数；（参见P147）,活菌计数：,采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数,第一节 微生物生长的测定,（二）以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法,（参见P147）,在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（optical

5、density,即O.D.）表示菌量。,实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。,第一节 微生物生长的测定,（二）以生物量为指标测定微生物的生长,2、重量法,（参见P147）,以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；,测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法,第一节 微生物生长的测定,（二）以生物量为指标测定微生物的生长,3、生理指标法,（参见P148）,微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪

6、、微量量热计等设备来测定相应的指标。,（参见P340，表12-12）,常用于对微生物的快速鉴定与检测,第二节 细菌的群体生长繁殖,微生物的特点：,个体微小,肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。,微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。,（参见P130）,对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,（参见P130）,生长曲线（Growth Curve）：,细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,在微生物

7、学中提到的“生长”，均指群体生长。,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,（参见P130）,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,（参见P130）,一条典型的生长曲线至少可以分为 迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,（参见P130）,迟缓期（Lag phase）：,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。,迟缓期的特点：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞 的平均长度比刚接种时长6倍

8、。一般来说处于迟缓期的细菌细胞 体积最大 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。,细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。,迟缓期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。（见P130）,调整代谢,迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。,在生产实践中缩短迟缓期的常用手段（参见P130）：,（1）通过遗传

9、学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；,（2）利用对数生长期的细胞作为种子；,（3）尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,（4）适当扩大接种量,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,（参见P131）,对数生长期（Log phase）：,又称指数生长期（Exponential phase）以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。,t1 t0 0.63

10、9G=n mm：比生长速率,（参见P132）,在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时（Generation time），在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doubling time）。代时通常以G表示。,纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。（参见P33）,影响微生物增代时间（代时）的因素：,1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同；,2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时

11、短,3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比，,凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子。,4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关。,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,（参见P131）,稳定生长期（Stationary phase）：,由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数）。,稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。,细胞重要的分化调节阶段；储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。也

12、是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,（参见P131）,衰亡期（Decline或Death phase）：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。,细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一

13、些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。,不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用（例如葡萄糖或NH+4等）；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。,（参见P131）,一、生长曲线,第二节 细菌的群体生长繁殖,（参见P130）,由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性

14、也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。,第二节 细菌的群体生长繁殖,二、同步培养,（参见P 133）,同步培养（Synchronous culture）：,使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。,以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。,同步生长：,通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物,第二节 细菌的群体生长繁殖,二、同步培养,（参见P 133-134）,同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。,

15、机械方法,离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法,环境条件控制技术,温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）,第二节 细菌的群体生长繁殖,二、同步培养,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,（参见P 134）,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。,三、连续培养,第二节 细菌的群体生长繁殖,将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。,分批培养（batch culture）or封闭培养（closed culture）,培养基一次加入，不予补充，不再更换。,连续培养（Continous culture）,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,（参见P135）,培养过程