核酸提取原理及方法_精品文档PPT推荐.ppt

1、主要储存遗传信息。p RNA主要传递遗传信息。主要传递遗传信息。/2011年年7月月核酸简介核酸简介 如何分离如何分离RNARNA？如何分离如何分离DNADNA？/2011年年7月月核酸简介核酸简介质粒质粒DNADNA 质粒质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从从1-200 kb不等，为双链、闭环的不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝有

2、自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息数，并表达所携带的遗传信息。/2011年年7月月1核酸简介核酸简介2基因组基因组DNA提取提取3质粒质粒DNA提取提取4真核细胞总真核细胞总RNA提取提取http:/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取方法提取方法基因组基因组DNA提取的几种常用方法：提取的几种常用方法：u CTAB法法u SDS法法u 其他方法其他方法http:/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法p CTAB法原理（法原理（植物植物DNA提取经典方法提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethy

3、lammonium bromide，十六，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法pCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-HCl （

4、pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 0.4 M2%（W/V）0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl（pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐

5、变，使酚容易去除。巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法pCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份组份 Tris-HCl（pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM0.4 M3%（W/V）5%（W/V）2%（V/V）使）使用前加入用前加入PVPPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少一种不溶的络合物质，有效去

6、除多酚，减少DNADNA中酚的中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。污染；/2011年年7月月p CTAB法实验流程法实验流程基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法植物材料植物材料 抽提抽提核酸沉淀核酸沉淀液氮研磨液氮研磨上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤http:/2011年年7月月p SDS法原理法原理SDSSDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（55556565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐（KAcKAc或或

7、NHNH4 4Ac）Ac）浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNADNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNADNA。基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法注：注：SDS法适用于大部分实验材料基因组法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。细胞、全血、细菌、酵母等。/2011年年7月月pSDS提取缓冲液的配方提取缓冲液的配方基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法组

8、份组份Tris-HCl（pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度50 mM 20 mM 0.4 M 2%Tris-HClTris-HCl（pH8.0pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）：EDTAEDTA：螯合：螯合MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑制离子，抑制DNaseDNase活性；NaClNaCl：提供一个高盐环境，使：提供一个高盐环境，使DNPDNP充分溶解，存在于液相中。充分溶解，存在于液相中。/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法p SDS法实验流程（以动物组织为例）法实验流程（以动物组织为例）动物组织动

9、物组织 抽提抽提酒精沉淀酒精沉淀液氮研磨液氮研磨或匀浆或匀浆上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤http:/2011年年7月月基因组基因组DNADNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测小鼠小鼠gDNA电泳图电泳图琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖凝胶作为以琼脂糖凝胶作为支持物，利用支持物，利用DNADNA分子分子在泳动时的电荷效应和在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离分子筛效应，达到分离混合物的目的。混合物的目的。/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取常见问题提取常见问题p DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后

10、续酶解和PCR反应反应p DNA降解降解p DNA量少量少http:/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应反应DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质中含有蛋白、多糖、多酚类物质 抽提纯化、高盐洗涤抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀重新沉淀DNA中残留有金属离子中残留有金属离子 重新重新70%乙醇漂洗乙醇漂洗http:/2011年年7月月基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA降解降解材

11、料不新鲜或反复冻融材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染http:/2011年年7月月p DNA提取量少提取量少实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少 选取新鲜（幼嫩）材料选取新鲜（幼嫩）材料破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分 充分研磨、破壁酶、延长裂解时间充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全沉淀不完全 低温、延长沉淀时间低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失洗涤使得丢失DNA基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析http:/2011年年7月月1核酸简介

12、核酸简介2基因组基因组DNA提取提取3质粒质粒DNA提取提取4真核细胞总真核细胞总RNA提取提取5琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳http:/2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取p 质粒质粒DNA提取的方法：提取的方法：碱裂解法碱裂解法煮沸法煮沸法http:/2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取碱裂解法原理碱裂解法原理http:/2011年年7月月离心柱型质粒离心柱型质粒DNADNA提取试剂盒工作原理提取试剂盒工作原理 离心柱型质粒离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的提取试剂盒采用改进的SDS-碱裂碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低解法裂解细胞，离心吸附柱内的

13、硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的值的洗脱缓冲液将纯净质粒洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。从硅基质膜上洗脱。/2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取及检测提取及检测实验准备实验准备1.实验器材实验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、marker笔、笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、

14、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.实验耗材实验耗材 无菌无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格管、各规格Tip、一次性手套等。、一次性手套等。3.实验试剂实验试剂 质粒小提试剂盒（离心柱型，质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO）、LB培养基、抗生素、培养基、抗生素、琼脂糖、琼脂糖、DNA Loading Buffer、GoldView核酸染料、核酸染料、TAE电泳缓冲液等。电泳缓冲液等。4.实验材料实验材料 对数期菌株（对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5）http:/2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取碱裂解法碱裂解法p 碱裂解法试剂配方碱裂解法试剂配方组分组分1组分组分2液液25 mM Tris-HCl（pH 8.0）10 mM EDTA（pH 8.0）液液0.2 M NaOH1%SDS 液液3 M KAc（pH 4.2）RNase A10 g/ml RNase A洗脱液洗脱液 EB10 mM Tris-HCl（pH 8.0）1 mM EDTA（pH 8.0）http:/2011年年7月月质粒质粒DNADNA提取提取实验流程实验流程对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解 上清液上清液 过柱过柱干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤质粒质粒DNADNA溶液溶液离心详细实验步