基因工程12-酵母基因工程_精品文档PPT文档格式.ppt

1、目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属酵母属 如酿酒酵母（如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕其中酿酒酵母

2、的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。赤酵母表达外源基因最理想。提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型ssc1 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌ssc2 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达rgr1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达ose1 提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达ssc11 改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌rho-提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达突变类型突变类型生物效应生物效应抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿

3、主菌能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnn 甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型och 外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖许多真核生物的蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核糖基核心心和和外侧糖链外侧糖链两部分组成。两部分组成。酵母菌普遍拥有蛋白质酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生型酿的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化酒酵母对异

4、源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此选择超糖基化缺倾向，因此选择超糖基化缺陷株非常重要。陷株非常重要。减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysHOOCUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3 Lysubiquitin ligase E3 Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI 1 编码泛素编码泛素-羧基

5、延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 2 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 3 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI 4 编码泛素五聚体编码泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定期表达稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解

6、途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，基因表达，UBI 4-突变株能突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体缺陷突变株是外源基因表达理想的受体UBI 4缺陷型：缺陷型：Ubc4-ubc5 双突变型：双突变型：泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效C 酵母菌的载体系统酵母菌的载体系统酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型

7、质粒酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒酿酒酵母中的酿酒酵母中的2m m环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有几乎所有的酿酒酵母中都含有2m m双链环状质粒，拷贝数达双链环状质粒，拷贝数达50至至100个。个。酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建含有含有ARS的的YRp质粒的构建质粒的构建n酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括自主复制序列、标记酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括自主复制序列、标记基因、克隆位点、大肠杆菌质粒基因、克隆位点、大肠杆菌质粒DNA。n以以ARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRp。n以以2m m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件

8、为复制子的质粒称为YEp。上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但个，但培养几代后，质粒的丢失率高达培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配，主要是由于分配不均匀所致。不均匀所致。含有含有CEN的的YCp质粒的构建质粒的构建 CEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNA着丝粒区，与染色体均匀分配有关着丝粒区，与染色体均匀分配有关的序列。的序列。将将CEN DNA插入含插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为的质粒中，获得的新载体称为YCp。YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1

9、-5个。含有含有TEL的的YAC质粒的构建质粒的构建含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNA同源序列的同源序列的YIp质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基特定序列和标记基因，构建出来的质粒称为因，构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染特定序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体色体DNA区域。区域。D 酵母菌的转化系统酵母菌的转化系统转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化程序酵母菌的转化

10、程序用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、等）、PEG、热休热休克处理后，也可高效吸收质粒克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：而且具有下列特性：吸收线型吸收线型DNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNA，两者相差两者相差80倍倍共转化现象极少发生共转化现象极少发生酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序酵母菌电击转化法酵母菌电击转化法优点：优点：不依赖于受体细胞的遗传特征不依赖于受体细胞的遗传特征培养容易培养容易转化率

11、可高达转化率可高达105/m mg DNA。转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运单链的转化率是双链的单链的转化率是双链的10-30倍倍含有复制子的单链质粒进入细胞转化为双链并复制含有复制子的单链质粒进入细胞转化为双链并复制不含复制子的单链质粒进入细胞后能高效地同源整合不含复制子的单链质粒进入细胞后能高效地同源整合克隆在克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有染色体整合型质粒上的外源基因，如果含有染色体DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80%用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 用于

12、酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类因和显性基因两大类 营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因显性标记基因的编码产物是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因显性标记基因 aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418 cat

13、氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型E 酵母菌的表达系统酵母菌的表达系统外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性pho4TS-PHO5启动子：启动子：酿酒酵母中酿酒酵母中PHO5启动子的正调控因子是启动子的正调控因子是PHO4PHO4温度敏感型突变基因温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在的编码产物在35时失活时失活装在装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在启动子下游的外源基因在35时关闭时关闭23诱诱导表