分解纤维素的微生物的分离--公开课_精品文档PPT推荐.ppt

1、人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。料等。2.2.纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它，一般认为它至少至少包括三种组分包括三种组分，即，即C C1 1酶酶（外切酶外切酶）、C CX X酶酶（内切酶内切酶）和和葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤

2、维素CX酶：酶：内切酶，使纤维素断裂成片断。C1酶：外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖外切酶，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖 分子，产生纤维二糖分子，产生纤维二糖葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解成葡萄糖。取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验 滤纸崩溃法滤纸崩溃法各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液1111mlml和和1010mlml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1 1mLmL纤维素酶纤维素酶两支试管固定

3、在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是：甲试管的作用是什么？什么？提示：本实验的本实验的自变量是纤维素酶的有无自变量是纤维素酶的有无，自变，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的蒸馏水，否则会影响溶液

4、的pHpH。实验分析：P P2727的小实验是如何构成对照的小实验是如何构成对照的？的？刚果红染色法刚果红染色法 刚果红刚果红能与能与纤维素形成红色复合物纤维素形成红色复合物，而不与，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选 当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复红色复合物合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现维素的

5、复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就，这样我们就可以通过可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。二、实二、实 验验 设设 计计 请你根据实验流程图和提供的三个资料以及请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作操作提示提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。实验方案。土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释 将样品涂布在鉴别纤将样品涂布在鉴别纤 维素分解菌的培养基上维素分解菌的培养基上 筛选产生透筛选产生透 明圈的菌落明圈的菌落

6、分布环境分布环境1 1、土壤取样：、土壤取样：富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中操作步骤操作步骤 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中的环境中纤维素分解菌的含量相对提高纤维素分解菌的含量相对提高，因此从，因此从这种土壤中这种土壤中获得获得目的微生物的目的微生物的几率要高几率要高于普通环于普通环境。境。原因原因实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。累的枯枝败叶等。讨论讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认在土壤中

7、，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？为滤纸应该埋在土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境适宜环境。一般应将滤纸埋于深约。一般应将滤纸埋于深约10cm10cm左右的左右的土壤中。土壤中。2 2、选择培养、选择培养 增加纤维素分解菌的浓度增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。样品中分离所需要的微生物。目的：制备选择培养基：操作：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基选择培养基的锥形瓶的锥形瓶中，将

8、锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养荡培养12天，直至培养液天，直至培养液变浑浊变浑浊。也可重复。也可重复选择培养。选择培养。培养基成分分析培养基成分分析 培养基组成培养基组成 提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉素粉 5g 碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g 氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g 无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、碳源、氮源生长因子、碳源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸溶解后，蒸馏

9、水定容至水定容至1000mL水水提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤或者将纤维素改为葡萄糖。维素改为葡萄糖。A A A A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）B B B B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，、这个培养基对

10、微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？是如何进行选择的？有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。分解纤维素的微生物可以大量繁殖。C C C C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用 说明：说明：分析分析“纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的选择培养基配方配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也

11、能在该培养基中量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。繁殖。在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适适应应这种营养条件的微生物得到这种营养条件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那，而那些些不适应不适应这种营养条件的微生物的繁殖被这种营养条件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此可以起到因此可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物所需的微生物？比较项目比较项

12、目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素尿素做氮源的选择做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉纤维素粉做碳源的做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养思考：本实验的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些中的实验流程有哪些异同？异同？本实验流程与课题本实验流程与课题2 2的流程的区别如下。课的流程的区别如下。课题题2 2是将土样制成的菌

13、悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌得到菌落。本课题通过落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。他步骤基本一致。按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释1011021031041051064.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤

14、维素分解菌的培养的培养基上基上（1 1）制备）制备鉴别培养基鉴别培养基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布到平板培养基上，涂布到平板培养基上，3030倒置培养。倒置培养。培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基（水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲