RT-PCR反转录原理及方法_精品文档PPT资料.ppt

1、8 8 8 8、弃上清，空气干燥、弃上清，空气干燥、弃上清，空气干燥、弃上清，空气干燥5-105-105-105-10分钟（不能完全干燥），溶于分钟（不能完全干燥），溶于分钟（不能完全干燥），溶于分钟（不能完全干燥），溶于DEPCDEPCDEPCDEPC水中至水中至水中至水中至20l20l20l20l（可在（可在（可在（可在55-6055-6055-6055-60水中，水中，水中，水中，10101010分钟助溶）。分钟助溶）。9 9 9 9、紫外分光光度计测总、紫外分光光度计测总、紫外分光光度计测总、紫外分光光度计测总RNARNARNARNA浓度。浓度。步骤2反转录（RT）逆转录反应：逆转录反

2、应：1 1、试剂、试剂、试剂、试剂 浓度浓度浓度浓度 体积体积体积体积 终浓度终浓度终浓度终浓度 RNA 23l（11.5l）RNA 23l（11.5l）Oligo（dT）15 0.05g/l 4l（2l）0.005g/l Oligo（dT）15 0.05g/l 4l（2l）0.005g/l 混匀，离心，混匀，离心，混匀，离心，混匀，离心，70 5min70 5min。2 2、立即冰水浴，稍离心、立即冰水浴，稍离心、立即冰水浴，稍离心、立即冰水浴，稍离心 试剂试剂试剂试剂 浓度浓度浓度浓度 体积体积体积体积 终浓度终浓度终浓度终浓度 M-MLV Buffer 5 8l（4l）1 M-MLV B

3、uffer 5 8l（4l）1 dNTPdNTP 10mM 2l（1l）0.5mM 10mM 2l（1l）0.5mM RNasinRNasin 40U/l 1l（0.5l）20 40U/l 1l（0.5l）20 M-MLV 200U/l 2l（1l）200U M-MLV 200U/l 2l（1l）200U 总体积总体积总体积总体积40l40l（20l20l）混匀，离心，）混匀，离心，）混匀，离心，）混匀，离心，42 60-90min42 60-90min。3 3、95 10min95 10min（破坏（破坏（破坏（破坏MLVMLV），），），），44保存。保存。步骤3聚合酶链反应（PCR）n

4、nPCRPCR反应：反应：反应体系：总体积反应体系：总体积20l（50l）20l（50l）试剂试剂 浓度浓度 体积体积 终浓度终浓度 TaqTaq Buffer 10 Buffer 10 2l（5l_）1 2l（5l_）1 dNTPdNTP 10mM 0.2l（0.5l）200uM 10mM 0.2l（0.5l）200uM 上游引物上游引物 10pmol/l 0.3l（1l）10pmol 10pmol/l 0.3l（1l）10pmol 下游引物下游引物 10pmol/l 0.3l（1l）10pmol 10pmol/l 0.3l（1l）10pmol cDNAcDNA模板模板 （1-10l）（1-

5、10l）TaqTaq酶酶 2.5U/l 0.3l（1l）2.5U/l 2.5U/l 0.3l（1l）2.5U/l DEPCDEPC水水 20l-4.3l20l-4.3l混匀混匀 反应条件：反应条件：95 595 5分分 预变性预变性 94 3094 30秒秒 变性变性 X 40X 40秒秒 退火退火 72 3072 30秒秒 延伸延伸 72 772 7分分 终末延伸终末延伸 28-3628-36循环，循环，44保温保温 步骤4琼脂糖凝胶电泳n n加1-10l PCR产物与上样缓冲液（1-2.5l）混匀，加样，电泳。所需材料及试剂n n一、实验器具与材料：一、实验器具与材料：1 1、移液枪：、移

6、液枪：1ml1ml、200l200l、20l20l、10l10l、2l 2l 2 2、吸头：、吸头：1ml1ml、200l200l、20l 20l 3 3、匀浆管：、匀浆管：5ml 5ml 4 4、吸头台：放置、吸头台：放置1ml1ml吸头的一个，放置吸头的一个，放置20l20l吸头的一个吸头的一个 5 5、EPEP管：管：1.5ml1.5ml、0.2ml0.2ml、100l 100l 6 6、试剂瓶：、试剂瓶：2 2个个60ml60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）的棕色试剂瓶（广口，带盖）1 1个个125ml125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）的白色试剂瓶（放无水乙醇）7 7、量筒：、量筒：5

7、0ml50ml、250ml250ml、500ml 500ml 8 8、容量瓶：、容量瓶：250ml250ml、500ml500ml、1000ml 1000ml 9 9、试管架：、试管架：5ml5ml、1.5ml1.5ml、20l 20l 1010、盐水瓶：、盐水瓶：250ml250ml、500ml500ml各各2 2个备用，一个装无水乙醇，另一个装个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPCDEPC水水 1111、铝制饭盒：、铝制饭盒：4 4个个 1212、塑料小饭盒：、塑料小饭盒：1 1个个 1313、大瓷缸：、大瓷缸：2 2个个 1414、锡泊纸：一卷、锡泊纸：一卷 1515、卷纸：、卷纸：2

8、 2卷卷 1616、三角烧瓶：带盖，稍大、三角烧瓶：带盖，稍大 所需材料及试剂n n二、实验器具的处理与准备二、实验器具的处理与准备二、实验器具的处理与准备二、实验器具的处理与准备 1 1、塑料制品：（包括枪头、塑料制品：（包括枪头、EPEP管、匀浆管等）管、匀浆管等）先将先将DEPCDEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入中，其中小枪头需要吸管打入DEPCDEPC水，过夜，然后高压，再水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次 2 2、玻璃

9、制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPCDEPC水泡）（洗净后先泡水泡）（洗净后先泡1 1DEPCDEPC过夜，再高压）过夜，再高压）3 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤所需材料及试剂n n三、试剂配制：三、试剂配制：1 1、DEPCDEPC水：吸出水：吸出1ml1ml放在放在1000ml1000ml双蒸水中配成双蒸水中配成1 1DEPCDEPC水，水，放在放在1000ml1000ml容量瓶中静置容量瓶中静置4 4小时备用。小时备用。2 2、75%75%乙醇：用无水乙醇乙

10、醇：用无水乙醇+DEPC+DEPC水配，然后放水配，然后放-20-20保存保存（其中（其中DEPCDEPC水需先高压）水需先高压）3 3、异丙醇：放入棕色瓶中、异丙醇：放入棕色瓶中 4 4、氯仿：放入棕色瓶中、氯仿：放入棕色瓶中 5 5、琼脂糖、琼脂糖 所需材料及试剂四、几种缓冲液的配制：四、几种缓冲液的配制：1 1、电泳缓冲液：、电泳缓冲液：TrisTris 54g 54g 硼酸硼酸 27.5g 27.5g 0.5M EDTA 20ml0.5M EDTA 20ml？pH8.0 pH8.0 蒸溜水蒸溜水 1000ml 1000ml 5 5TBE TBE（贮存液）（贮存液）再将再将5 5TBET

11、BE稀释稀释1010倍成倍成0.5TBE0.5TBE就可以在电泳时使用（即工就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取作液浓度），如取50ml50ml贮存液贮存液+450ml+450ml水水-500ml-500ml工作缓工作缓冲液冲液 2 2、上样缓冲液：、上样缓冲液：0.25%0.25%溴酚蓝溴酚蓝 0.25%0.25%二甲苯青二甲苯青FF FF 30%30%甘油甘油 6 6缓冲液，缓冲液，44保存保存 所需材料及试剂n n五、琼脂糖凝胶的配制：五、琼脂糖凝胶的配制：1 1、1.0%1.0%：1.0g1.0g琼脂糖琼脂糖+100ml+100ml电泳缓冲液，微波炉中火电泳缓冲液，微波炉中火3030秒秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至至沸腾，熔化的琼脂物冷却至6060时加入时加入10mg/ml10mg/ml溴化乙锭溴化乙锭（Golden View）5l（Golden View）5l，充分混匀，将温，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置置30-45min30-45min后进行电泳。后进行电泳。2 2、1.5%:1.5%:同上，将琼脂糖的量改为同上，将琼脂糖的量改为1.5g（1.5g（分辨率要求高时使分辨率要求高时使用用）所需材料及试剂n n六、需购置的六、需购置的六、需购置的六、需购置的RtRtRtRt-PCR-PCR-PC