CRISPR-Cas9系统原理应用及发展_精品文档PPT推荐.ppt

1、一种来源是细菌获得性免疫的由：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR-Cas主要由两部分组成：主要由两部分组成：识别识别切割切割1 CRISPR-Cas概述概述1.1 CRISPR结构结构CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）CRISPR 是一个特殊的是一个特殊的DNA重复序列家族重复序列家族,广泛分布于广泛分布于细菌和古细菌基因组中。细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守位点通常由短的高度保守的重复

2、序列的重复序列（repeats）组成组成,重复序列的长度通常重复序列的长度通常 2148 bp,重复序列之间被重复序列之间被 2672 bp 间隔序列间隔序列（spacer）隔开。隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。）与靶基因进行识别。1.1 CRISPR结构结构1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）：存在于存在于CRISPR位点附近，是一种双链位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，酶功能类似，但是它并

3、不需要形成二聚体才能发挥作用。但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行通过对入侵的病毒和核酸进行特异性特异性的识别，利用的识别，利用Cas蛋白进蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。行切割，从而达到对自身的免疫。2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免特异

4、性免疫疫,而这种特异性是由间隔序列（而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（序列（spacer）来实现的。）来实现的。2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）

5、为）为NGG。2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求 在人类基因组中，平均每在人类基因组中，平均每8bp就出现一个就出现一个NGG PAM。2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰系统介导基因修饰3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换介导编辑模板替换 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系统用设计好

6、的统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。修饰。3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换介导编辑模板替换3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。3.2

7、sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰Cas9sg-RNA 2013年年2月月15日在日在science上发表的上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。实现了同时对两个基因进行编辑。3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰介导双基因修饰 3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰介导双基因修饰 4 CRISPR-Cas系统

8、前景分析系统前景分析 这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。可能获得诺贝尔奖技术。4 CRISPR-Cas系统前景分析系统前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上发表的上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者一文中，作者利用利用TALENs和和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为对同一基因进行修饰，效率分别

9、为0%-34%和和51%-79%。4 CRISPR-Cas系统前景分析系统前景分析 而且从实际应用的角度来说，而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比比TALENs更更容易操作，因为每一对容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替换只需要替换20个核苷酸就行。个核苷酸就行。4 CRISPR-Cas系统前景分析系统前景分析u只需合成一个只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。蛋白不具特异性。u编码编码sgRNA的序列不超过的序列不超过100bp，因此比构建，因此比构建TALENs和和ZFNs更简单方便。更简单方便。u较短的较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的序列也避免了超长、高度重复的TALENs编编码载体带来的并发症。码载体带来的并发症。技术优势