南通大学译文五味子中的5羟甲基糠醛5hmf对酒精性肝损伤小鼠的改善作用Word文档下载推荐.docx

1、本文的目的是探讨5-羟甲基糠醛（5-HMF）对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用，5-HMF，是一种从五味子果实中分离出来用于动物实验的一种美拉德反应产物，实验小鼠分别与不同浓度的5-羟甲基糠醛预处理（7.5,15，和30毫克/千克）进行灌胃喂养七天。检查了血清以及肝组织的生化标记和酶抗氧化剂，我们的结果表明肝组织中的ALT活性（谷氨转氨酶），AST（谷草转氨酶），TC（总胆固醇），TG（甘油三脂），L-dlc（低密度脂蛋白）和血清中的MDA（丙二醇）指标，用5-hmf的组与酒精组相比显著降低（p0.05）。相反，酶抗氧化剂CAT（过氧化氢酶），谷胱甘肽过氧化物酶（谷胱甘肽过氧化物酶），SOD（超

2、氧化物歧化酶）等指标在5-HMF组中明显升高（P0.05）。此外，炎症反应标记肿瘤坏死肝水平因子-（TNF-）和白细胞介素-1（IL-1）显著抑制（P0.05）。组织学检查发现，经5-羟甲基糠醛（30毫克/公斤）预处理的明显防止酒精引起的肝细胞凋亡和脂肪变性。这表明5-HMF对酒精性肝损伤的保护作用可能是由于其强大的抗氧化性能力。 关键词：5-羟甲基糠醛；五味子；酒精性肝损伤；氧化应激1. 导言 越来越多的证据表明，长期酒精滥用和酒精依赖导致许多疾病，如营养不良和酒精性肝病（ALD）。一般来说，氧化应激和脂质过氧化作用在酒精性肝病的发病机制中起重要作用。由于氧化应激参与ALD的发应，使用抗氧化

3、剂可能会削弱乙醇诱导的氧化应激和预防机制。因此，抗氧化剂最主要的来源和它们在防止乙醇引起的肝损伤起的作用是一个重要的研究目的。5-HMF是一个著名的美拉德反应产物，主要用酸催化脱水果糖产生的一系列产物。有趣的是，它也发现在大量的热加工的中药中，如枸杞,山茱萸,生地黄,何首乌以及五味子。最近几十年，有许多关于5-HMF致突变，有毒性的讨论。因此，蜂蜜啤酒和咖啡中的5-羟甲基糠醛含量一直严格的控制。尽管以前对5-HMF的危险性有很多关注，但近些年来有关5-HMF有生物活性的理论逐渐被接受。据报道，5-HMF具有良好生物学效应，如抗氧化活性，抗缺氧，和镰状红抑制血细胞。我们知道，缺氧性损伤的机制包括

4、氧化应激过程，5-HMF能保护肝细胞系以免在体外H2O2诱导损伤。因此，它对体内可能引起肝损伤的分子机制十分敏感。在这里，此次研究的目标是进一步探讨5-HMF可能对急性肝损伤和酒精性肝损伤小鼠的保护作用。2.结果和讨论2.1.从五味子分离和分析5-羟甲基糠醛夏腊梅果实被用于肝损害的中药已经好几个世纪了，除了木脂素，来自热处理过的5-HMF具有保肝和抗氧化作用，这时对五味子的5-HMF进行高效液相色谱法。结果表明，样品中的5-HMF的含量处于2.50.2毫克/克。2.2.5-HMF对体重和脏器指数的影响体重是健康的一个重要指标，在本研究中，酒精组的小鼠体重和5-HMF组相比没有发生变化。计算出小

5、鼠的肝和脾的脏器系数，与先前的研究相比，酒精组（p0.05）小鼠的肝脾的脏器指数与对照组相比显著增加,不过与5-HMF组相比降低了15和30毫克/公斤。2.3.5-羟甲基糠醛对血清生化指标的影响血液中AST和ALT的泄漏间接反映了乙醇引起的肝衰竭和肝中毒，正如表2中显示的那样，酒精注射12小时后血清中ALT，AST水平显著升高（p0.05），这说明肝细胞已经损伤，酒精性肝损伤模型已经成功建立。然而，经5-HMF处理七天后的血清生化指标与酒精处理过的相比显著降低。值得注意的是，用不同剂量5-HMF处理酒精组可使其肝功能逐渐恢复。越来越多的证据表明，脂肪变性的特点是TG的积累。这是消耗乙醇的一个重

6、要反应，与控制相比，酒精组中的TG，TC，L-DLC的水平显著升高。然而在5-HMF组中它们的水平降低和倒转到可控制的水平。有趣的是，治疗组对酒精诱导的脂质过氧化的作用有明显的剂量依赖性。2.4.5-羟甲基糠醛对肝生化活性的影响氧化应激是一种对乙醇诱导肝损伤的机制。为了消除氧化压力，许多酶和非酶的机制.这些抗氧化酶包括CAT，GSH-Px，SOD。如图，与对照组相比，肝抗CAT，GSH-Px和SOD活性在酒精组分别降低43.2%，52.7%，和18.8%。然而，用5-HMF完全预处理七天可以防止降低。MDA是一种分解产物，已被用来作为生物标志物用于检测肝脏脂质过氧化的影响。相反的是，与正常组相

7、比，在酒精组中MDA含量升高57.01%。然而，经5-HMF处理的小鼠MDA浓度明显升高。2.5。5-羟甲基糠醛对肝脏炎症标志物的影响TNF- and IL-1激活，两个主要的炎症介质参与炎症，在酒精性肝损伤中起着至关重要的作用。TNF-和IL-1可引起肝细胞损伤和死亡。为了探讨乙醇对炎性反应的影响，对TNF-和IL1B在肝组织的表达的部分是由酶联免疫吸附法测定与确定。如图4所示，结果显示，酒精注射后肝脏中的TNF-和IL1B有相当大的增长，分别为43.1和61.4。与5-HMF可以防止TNF-诱导的单核细胞粘附这一结果一致，经5-HMF减毒处理后的组与酒精组相比TNF-和IL1B有很强的活性

8、。2.6.病理观察下图显示不同治疗组中所获得的肝脏具有代表性的肝脏显微照片。正常组的肝小叶清晰，结构规则并有中央静脉线，细胞核正常无水肿，脂肪变性和可见病变。然而，在酒精组中，典型的病理特征包括坏死，炎性浸润和广泛的空泡变性，这证实了酒精性肝损伤模型的成功建立。用阳性药物处理（护肝片）和5-HMF处理，结果显示5-HMF可以对酒精引起的和损害起到一定的保护作用，而用护肝片处理的仅表现为轻微的肝细胞坏死和炎细胞浸润。酒精处理前用高剂量的5-HMF治疗（30毫克/千克）可明显减轻细胞凋亡和炎症，几乎接近于正常组。从结果，我们推测5-HMF预处理可以减轻乙醇诱导的肝损伤。2.7。肝脏病理学分类和分级

9、从分级和分期系统来看，坏死性炎症不仅可以衡量坏死程度而且可以推测可能的疾病反应和参数。如表3所示，肝脏病理变化主要是由肝细胞脂肪变性所致，主要发生在中央静脉。相对于正常组，酒精组表现出明显的肝损伤。对照组和经5-HMF处理的组脂肪变性状态有不同程度的减轻。Huganpin是一种肝保护剂，用于预防和治疗肝损伤。在实验中，350 mg/kg的剂量是指日常用量。作为一种积极药物，Huganpin显著影响酒精诱导肝损伤的保护作用。3.实验部分3.1。化学品和试剂夏蜡梅果实是在通化市收集，并由中国农科院特殊野生经济动物和植物研究所的王英平教授检验。丙氨酸氨基转移酶（ALT），谷草转氨酶（AST），甘油三

10、酯（TG），总胆固醇（TC），低密度脂蛋白胆固醇（l-dlc），过氧化氢酶（CAT），丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的商业试剂盒从南京建成生物工程研究所购买。护肝片（批号091103），肝保护剂，主要含柴胡，板蓝根、五味子是从浙江医药有限公司采购。肿瘤坏死因子-（TNF -）和白介素1receptor（IL-1）是R&D系统采购。HPLC级甲醇是从美国的Fisher化工厂采购。其他化工用品，比如酒精都是从中国北京的化工厂采购。3.2。5-羟甲基糠醛的提取，分离和分析将200克干燥的五味子粉末放入容量瓶中并加入5升酒精，40度超声水浴30分钟三次。

11、提取后，在45度下将过滤的溶液浓缩干燥。提取的物质装上硅胶柱。以上部分在（10%的甲醇）半制备的流动相中分离纯化然后加入202毫克的5-HMF。在UV,NMR,EMI-MS的基础上通过光谱和元素分析的标准中比较HPLC的保留时间和以往报告的数据对5-HMF的结构加以阐明。 采用紫外检测器，岛津分析中心系统的高效液相色谱分析测定五味子中的5-HMF。HPLC方法采用Hypersil bds2柱（250*4.6毫米，5微米）。柱温为30C，检测波长为280 nm。流动相为1毫升/分钟的10%甲醇。20L样品溶液的流量直接注入色谱柱。高效液相色谱如图2所示。 3.3动物四十八只4周龄的ICR小鼠，体

12、重为2022 g，用于酒精性损伤的实验。实验动物由吉林大学提供，质量证书号为SCXK（JI）2011-0004（长春，中国）。饲养在拥有25 2C ，12小时黑暗/光照周期的空调房间内。所有对实验动物的使用及保养均按照中国的法律。3.4。实验组和治疗动物随机分为六组（每组8只），正常对照组，乙醇对照组，阳性对照组以及三组实验组。实验组用5-HMF灌胃处理，连续七天的剂量分别为7.5,15,30毫克/公斤每天。除了阳性对照，正常组和酒精组只有0.9%的生理盐水。第七天,正常对照组给予同等体积的水，其他小鼠用50%的乙醇（4.8克/公斤）进行最后一次灌胃。然后所有的小鼠禁食12小时。采集血标本及球

13、后在室温下保存45分钟，一小时后分离血清并离心（1500转，10分钟，4）保存在-20进行生化分析。另外，实验前后，分别称取动物体重。实验结束后，各组小鼠用脊椎脱位的方法处死。快速解剖取出肝脏和脾脏，用生理盐水冲洗两次，然后用滤纸擦干，测定湿重。与此同时，记录尺寸，外观和切割面的纹理。从每只小鼠肝左叶取一小块组织固定于10%的福尔马林溶液中进行病理学分析。剩余肝组织存储在-80环境下进行肝匀浆制备。3.5。血清生化标志物的检测。使用南京建成生物工程研究所（中国南京）的试剂盒测定血清中的AST,ALT,TC,L-DLC和TG等指标。3.6。肝脏的抗氧化活性和氧化应激标记物检测为了测定抗氧化活性，

14、将肝组织混匀在50mM的磷酸盐缓冲液中（ph7.4）。产生的缓冲液在4下离心15分钟，上清液用于测定。肝匀浆中的CAT，GSH-Px和SOD水平是根据试剂盒的说明测定（南京建成生物工程研究所）。CAT活性用过氧化氢的方法测定，其次是用克莱本的方法测定。GSH-Px活性根据莫汉等人的方法测定。SOD活性采用波尚等人的方法测定。丙二醛（MDA）通过测定形成的硫代巴比妥酸反应物质。这些物质是由德雷珀和哈德利所描述的。用Bradford法测定蛋白质的含量。3.7。炎症标记物活性测定无血清培养基中TNF-和IL1B的水平由制造商确定（明尼阿波利斯，MN，USA）。总的来说，将制备的试剂，样品用酶标记后在37下反应60分钟。加入终止液后，十分钟内测定好OD值。3.8。组织病理学检查将肝组织（每组数量为8）固定在10%中性福尔马林缓冲液（福尔马林：磷酸盐缓冲液（0.01 M，pH 7.4）= 1:1）24小时以上，用常规石蜡包埋，在切片5m厚处标记。经苏木精-伊红（H&E）染色，切片组织病理学变化用尼康TE 2000荧光显微镜观察（尼康，东京，日本）。这呈现了有代表性的图像。组织病理学特征为肝脏的组织学变化的评估，包括肝细胞变性或坏死，脂肪变性，炎症细胞浸润，充血提供了依据