1、塞上胶塞,然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时,将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。4.2.2 三角瓶、抽滤瓶:将三角瓶(抽滤瓶)口塞上胶塞,然后用牛皮纸把塞头部包起来。4.2.3 吸管:将耐高温的移液枪头装盒,用用牛皮纸或报纸包裹。4.2.4 平皿:10个为一组,用牛皮纸包裹。4.3消毒和灭菌:4.3.1 化学灭菌:此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。(1)用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。(2)一般用12%的甲醛液浸泡软管和用具。(3)一般成品漂白粉的有效成分是2532% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内,(对金属有腐蚀作用
2、)放置1015min后冲洗即可。(4)氯灭菌剂的能力以有效氯表示,将氯水配制成50100PPm 的有效氯溶液,可用于浸泡,冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。4.3.2 物理灭菌:4.3.2.1 干热灭菌:适用于干燥的玻璃器皿(吸管、平皿等)、金属器具(镊子等)、固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160干热空气灭菌2h。(1)器具用牛皮纸或灭菌袋包(装)扎,放入金属容器内。(2)器具在干燥箱加热前放入,每个器具之间留有足够的空隙,使热空气能畅通。(3)关闭箱门接通电源,打开通气孔,使箱内湿空气能逸出,至箱内温度达到100时关闭。(4)加热至160,保持2小时。(5)切断电源,冷却至60
3、 时,打开箱门,取出灭菌器具,并打开箱顶通气口。注:灭菌时必须注意温度不能超过180,以免使棉花、报纸烘焦;灭菌时不得打开箱门;干燥箱未冷却时,不要取出里面器具,防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸璃器具爆炸。4.3.2.2 湿热灭菌:适用于容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。详见压力蒸汽灭菌器操作规程。(1)装入培养基的瓶用胶塞盖上,再用牛皮纸包扎。(2)瓶中的培养液不要超过1L,否则灭菌不彻底。(3)容器的上部应留有足够的空间(一般不超过装量的2/3),以便产生气泡。(4)器具用牛皮纸包裹。(5)器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。(6)各类器具装入灭
4、菌器时,相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。4.4 无菌操作的准备工作及注意事项4.4.1 微生物室应定期按微生物实验室管理规程清洁。4.4.2 微生物室使用前,应先打开紫外灯灭菌2030min。4.4.3 微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针,每次使用前后应灭菌消毒。4.4.4 微生物室应备有75%酒精棉球;新洁尔灭消毒液内浸纱布数块,备用。4.4.5 进入微生物,换专用鞋,穿好洁净服,离室时脱去洁净服和专用鞋,洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用,不准穿到其它地方去,并定期洗换和消毒灭菌。4.4.6 样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容,并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期
5、等内容。4.4.7 无菌操作前,用75%的酒精棉球擦手。4.4.8 操作要正确迅速,所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。4.4.9 检验完毕,立即清理工作台,弃去不需要物品,打开紫外灯灭菌2030min。4.5 微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。4.5.1 水:电导率在25时不超过25s/cm,除非另有规定要求。4.5.2 称重和溶解:保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定,已制备好的培养基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min,使其与室温一致再使用,因为气体的溶解度可因温度上升而降低,特别是
6、乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡,这一点必须注意。4.5.3 pH 的测定和调整:用pH计测pH,必要时在灭菌前进行调整,除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25时,pH应在标准pH0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L(约1mol/L)的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L(约1mol/L)的盐酸溶液调整培养基的pH。4.5.4 分装:将配好的培养基分装到适当的容器中,容器的体积应比培养基体积最少大20%。4.5.6 培养基的使用:经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间,融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中(如2 min)以避免玻璃瓶破碎。融化后的培养基放入4750的恒温水
7、浴锅中冷却保温,且应尽快使用,放置时间一般不应超过4 h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意,融化后保温时间应尽量缩短,如有特定要求可参考指定的标准。4.5.7平板的制备和储存 倾注融化的培养基到平皿中,使之在平皿中形成厚度至少为3 mm(直径90 mm的平皿,通常要加入18 mL20 mL琼脂培养基)。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存,或者培养时间超过48h或培养温度高于40,则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和(或)53冰箱的密封袋中,以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记,标记的内容包括名称、制备日期
8、和(或)有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生,平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。对于采用表面接种形式培养的固体培养基,应先对琼脂表面进行干燥:揭开平皿盖,将平板倒扣于烘箱或培养箱中(温度设为2550);或放在有对流的无菌净化台中,直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。4.6 检验方法做样前,将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上,操作台、微生物室紫外线灭菌30min,然后关紫外线灭菌灯,开启净风循环30min后开始做样。详见附录各检
9、测方法附录1 菌落总数测定附录2 霉菌和酵母计数附录3 大肠菌群计数附录4 大肠埃希氏菌计数附录5 沙门氏菌检验附录6 金黄色葡萄球菌检验附录1 菌落总数的测定方法1. 样品的稀释1.1 固体和半固体样品:称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1 min2 min制成1:10 的样品匀液。1.2液体样品:以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:1.3 用1mL微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中(注意吸头尖端不要触及稀释液面),
10、换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。1.4 按4.6.1.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1 mL无菌吸头。1.5根据对样品污染状况的估计,选择2个3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。1.6 及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基(可放置461恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。2. 培养2.1 待琼脂凝固后,将平板翻转,361培养48h2h。2.2
11、如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4 mL),凝固后翻转平板,按4.6.1.2.1条件进行培养。2.3 菌落计数可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示。2.3.1选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到
12、平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。2.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。3 结果与报告3.1菌落总数的计算方法3.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。3.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按下式计算:式中:N样品中菌落数;C平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d稀释因子(第一稀释度
13、)。3.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。3.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.1.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。3.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。3.2 菌落总数的报告3.2.1 菌落数小于100 CFU时,按“四舍五入”
14、原则修约,以整数报告。3.2.2 菌落数大于或等于100 CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。3.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。3.2.4 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。3.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。附录2霉菌和酵母菌计数称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中,充分振摇,即1:10稀释液。1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。1.3 取1mL1:10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中, 另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为1:100稀释液。1.4 按1.
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