凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒Word下载.docx

1、整体操作约需3小时。 用途广泛：可应用于组织切片、细胞样本等。 方便观察：使用光学显微镜观察实验结果。 高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性使用注意事项1使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。2因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。3为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。4TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。5. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。6. 固定好的样本可以在-20的70%乙醇中放置30分钟或至过夜

2、，以改善细胞的渗透性。7. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。8. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。9. DAB为固体粉末，使用前加入PBS配制成20DAB（10 mg/ml）后，按说明书显色使用。二、TUNEL试剂盒组分组 份Cat: KGA702 20 assays KGA70350 assays KGA704100 assays储存条件Equilibration Buffer1.0 mL2.5 mL5.0 mL-20Biotin-11-dUTP20L50L100LTdT Enzyme80L200L400L50Proteinase K40LS

3、treptavidin-HRP10L25L4避光DAB2mg 5mg 10 mg试剂盒以外自备仪器和试剂光学显微镜、37孵箱、微量移液器、染色湿盒、盖玻片、载玻片、染色缸。二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、复染染液：苏木素或甲基绿等。三、操作流程概览四、检测样本的预处理TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 9），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。1细胞样本的准备操作注意事项：1. 为防止样本脱落，请使用硅

4、烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。2. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。3. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。4. 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。五、标记和显色反应1. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。2. PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4. TdT酶反应液即用即配，短暂于冰上保存。不

5、宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5. 如果20DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制。6. 苏木素复染：将切片放入苏木素染液，染色 30s-10min（根据样本做适当调整），蒸馏水冲洗干净后放入盐酸甲醇溶液中5s，立即用蒸馏水冲洗干净。分别用70%、85%、95%、无水乙醇浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。晾干后在切片上加中性树胶，加盖玻片。六常见问题的原因及推荐解决方案现象可能原因建议非特异性染色（例如：非凋亡细胞的强染色）Biotin-dUTP的非特异性结合勿使细胞干涸在TdT酶反应之后，再用含0.1% Triton X-100和1 mg/ml

6、 BSA 的PBS洗三次。TdT酶的浓度过高用TdT dilution buffer* 作1：21：10稀释，内源过氧化物酶未被封闭封闭液室温（15-25）封闭10min（封闭液： 3%H2O2溶于甲醇）光照紫外线导致包埋试剂的聚合（如：甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂）尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂在固定组织时样本DNA已断裂（内源核酸酶的作用）确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂用含有dUTP和 dAPT的溶液封闭染色背景较高福尔马林固定导致某些含黑色素前体的细胞染成黄色尝试以甲醇固定，但可能会降低检测的敏感性。样本被支原体污染使用支原体

7、检测试剂盒检测，如阳性则制备未被污染的新样本标记反应试剂（TdT酶及dUTP）的浓度过高稀释50%，以降低标记反应的浓度细胞处于高度增殖期在非高增殖期取样检测DAB孵育时间过长减少DAB染色时间标记率低、染色淡至无如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低（因为在固定时染色质未能与蛋白质交联，而在操作中丢失）用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定或福尔马林或戊二醛固定。过度的固定导致与蛋白过度交联缩短固定时间，或用溶于PBS PH7.4的2%多聚甲醛固定促渗条件不佳，以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低 增加通透剂促渗时间 增加通透剂的作用温度（15-25） 优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间

8、（如：以400ug/ml作用5min） 0.1M的柠檬酸钠70作用30min。复染信号较弱选择的染料不合适用溶于0.1M醋酸巴比妥的3-5%甲基绿PH4.0，或苏木素复染阳性对照没有信号DNase I的浓度过低 冷冻切片使用3U/mL的DNase I 石蜡切片使用 1500U/mL的DNase I 一般样本使用10U/ml DNase I 反应缓冲液：10mM Tris-HCl（ PH 7.9）， 10 mM NaCl, 5mM MnCl2, 10mM CaCl2， 25mM KCl2 ，37 反应30 min，PBS洗去。组织样本从载玻片脱落组织样本被酶从玻片消化下来降低蛋白酶K的处理时间*

9、TdT dilution buffer：60 mM KPB 缓冲液（pH7.2），150 mM KCl， 1 mM 2-mercaptoethanol， 50 % Glycerol 非离子表面活性剂 T riton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚） 免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。 30% Triton X-100的配制：试剂：Triton X-100 28.2ml 0.1mol/L PBS（pH7.3）或0.05mol/l TBS（pH7.4） 72.8ml 配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置3740水浴中23h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。