VIGS小知识总结_精品文档.docx

1、1. TRV1和TRV2共注射时，选择植株下部的叶子（lower leaves）；2. 一般注射后过2周左右时，发生基因沉默，这个时候进行表型分析；3. 用反转录定量PCR检测目的基因在VIGS植株中的表达量，一般TRV-VIGS能使目的基因的表达水平大约下调80%；4. 为了确保侯选siRNA 序列只沉默单一的靶基因, 侯选siRNA 序列应在美国NCBI (National Center for Biotechnology Information) 的EST 或Unigene 数据库进行BLAST 同源性比对。当siRNA 序列只同源于靶基因时，才可以用于下一步的基因功能研究。5. 为确保

2、对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因应该设计4条以上siRNA序列，进行化学合成后，通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA 序列进行下一步的基因功能研究。6. 烟草(Nicotiana benthamiana)植株中八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase)基因PDSGGCACTCAACTTTATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTGGAACATATTGAGT

3、CAAAAGGTGGCCAAGTCAGACTAAACTCACGAATAAAAAAGATCGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAATGTTTTATACTGAATAATGGCAGTACAATTAAAGGAGATGCTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGAAAACTGAAG7. VIGS 载体中对插入片段的方向并无要求，正义链方向及反义链方向的序列均可高效诱导基因

4、沉默(Alkinson et al., 1998; Bruun-Rasmussen et al., 2007)，但是对片段长度和序列特异性有一定的要求。Both sense and antisense orientations of the insert in the TRV2 vector have been shown to invoke similar VIGS.8. 用于VIGS的同源序列需要有较高的特异性，这样可以尽可能降低实验中的“脱靶”效应。“脱靶”是指siRNA 和非目的基因结合，导致非靶标基因沉默。9. 植物基因组中有大量的基因家族，家族间的基因序列相似性非常高，如果需要特异

5、性地沉默家族中的某个基因，则构建载体的同源片段必须适当的缩短长度以保持沉默的特异性。10. siRNA设计原则RNAi发挥作用的核心在于siRNA的序列结构，因此不同的siRNA导致的沉默效果差异非常巨大。影响siRNA功能因素主要包括siRNA序列结构特点、靶向mRNA的空间结构、RISC与siRNA的相互作用、以及siRNA与mRNA错配。目前siRNA设计的原则有两种方式：(1) 统计不同siRNA对靶序列抑制程度得到siRNA设计原则。这个原则就是统计目前已有的siRNA序列，根据序列特点和序列沉默效果分析得到。 a. GC含量在30%-52% b. 有义链15-19位至少有3个A或者

6、U c. 避免出现倒置重复，以防形成发卡结构 d. 有义链的第3位核苷酸为A e. 有义链的第10位核苷酸为U f. 有义链的第19位核苷酸为A g. 有义链的第19位核苷酸不能为G或C h. 有义链的第13位核苷酸不能为G(2) 以siRNA序列上的能量为依据，筛选有效序列。 a. 总的siRNA双联能量 b. 反义链5端的结合能 c. 有义链的5端结合能在5-9 e. GC含量在36%-53% f. 中间7-12位的结合能g. 反义链5端与正义链5端的能量差最好在-1011. 根据VIGS的作用机制，理论上引起目的基因沉默的最小插入片段为23bp，但是在实际操作中，23bp的核苷酸长度常常不能有效的启动目的基因沉默的发生，所以需要选择数倍于23nt的目的基因片段，但也不能过长。为了使目的基因能够有效地沉默，通过实验表明200-500bp插入片段的沉默效果最佳。当然，也可能存在其他影响沉默效果的因素，如目标基因序列的核苷酸组成、siRNA及目标序列的碱基对的热力学特性等。