干细胞向心肌细胞转化的途径Word格式文档下载.docx

1、Key words：Cardioid ; Stem cells; Myocardial cell引言心肌梗死和心力衰竭是严重威胁人类健康的疾病，其共同的病理改变是心肌的损伤。 心肌细胞是一种终末分化的细胞，再生能力非常有限; 目前针对心肌梗死和心力衰竭的治疗方法大多仅限于延缓疾病的进展。 因此，患有心肌梗死和心力衰竭的病人无法得到根本的治疗。而细胞替代治疗作为一种非常有前景的新方法，有望治疗心肌损伤。胚胎干细胞（ESC） 由于处于未分化状态，具有自我更新和多分化的潜能，在诱导因子的刺激下可分化成为心肌细胞，因此是细胞替代治疗较理想的细胞来源。1.血管紧张素II对胚胎干细胞向心肌细胞分化的作用胚

2、胎干细胞分化心肌细胞（ESC-CMs） 与成人心肌细胞的结构和功能特性相似1，具有收缩功能和表达心肌特异性基因，并且电镜结果显示，其肌纤维与早期心肌细胞相同。既往研究已经表明，内源性激素和神经递质可能影响干细胞的分化，如 u 和k 鸦片受体对胚胎干细胞向神经祖细胞分化是至关重要的2，胰岛素可抑制人胚胎干细胞向心肌分化3。 本课题组先前的研究4表明，小鼠胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞表达功能性血管紧张素II1型受体，血管紧张素II作为 AT1R的激动剂，其对心肌分化影响的研究还不清楚。 本研究目的是明确血管紧张素II对心肌分化的影响。血管紧张素II是肾素-血管紧张素系统的主要活性肽。血管紧张素II

3、主要通过AT1R发挥其主要生理和病理作用，如血管收缩，炎症反应，细胞增殖等。 近来有研究5报道，AT1R 在心脏功能失调中发挥重要的作用。另外AT1R 缺陷小鼠心脏萎缩，血压偏低，表明了AT1R在心血管系统发育中发挥重要的作用6。 近来有研究发现，血管紧张素II参与干细胞或前体细胞的分化，Ishizuka 等7报道了血管紧张素II通过 AT1R 促进诱导的多潜能干细胞分化为中胚层前体细胞。然而，血管紧张素II是否在心肌细胞的分化中发挥作用还不清楚。 另外，由于AT1R 阻滞剂洛沙坦在临床上常用于治疗心梗，考虑到干细胞在心肌损伤治疗中的临床应用潜能，有必要明确血管紧张素!对干细胞向心肌细胞分化的

4、影响，为将来的临床应用提供一定的线索。研究证实，AT1R 在间充质干细胞以及胰腺干细胞的分化中发挥一定的作用8-9不少研究也表明，AT1R在心脏系统的发育中发挥重要的作用5，6，10。然而，AT1R 在胚胎干细胞向心肌分化中作用还不清楚。 由于胚胎干细胞具有自我更新和多分化的潜能，在诱导因子的刺激下可分化为心肌细胞，是细胞替代治疗理想的种子细胞。 另外，AT1R阻滞剂洛沙坦在临床上广泛应用于治疗心梗。 因此，研究AT1R 在胚胎干细胞向心肌细胞分化中作用具有非常重要的意义。 从我们的结果来看，激活AT1R 可能有利于心肌细胞的分化，而阻断AT1R会部分阻碍这种有利的作用。总之，我们通过工具药激

5、动或抑制AT1R，第一次证实了AT1R激动剂 AII能够促进心肌分化，抑制AT1R可部分阻碍这种作用。 本研究为将来干细胞应用到临床时药物的使用提供了一定的参考依据。2.Smad信号通路在骨髓源性心肌干细胞向心肌分化中的作用Smad信号通路在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中发挥重要的介导作用。MCSCs是从成年鼠骨髓中筛选的已提交心肌谱系的多能干细胞，在体外诱导条件下或者在体内特定的微环境中，MCSCs可以分化为心肌细胞和再生血管15。近来研究显示，BMP_2在胚胎心脏的发生以及干细胞向心肌分化方面发挥重要作用。本实验和我们先前实验的结果证实，BMP_2可将MCSCs诱导分化为心肌。诱导后

6、的细胞在形态上发生了明显改变，细胞相互连接形成肌管，细胞内早期转录因子Nkx215、GATA_4的表达增强，并表达心肌特异性基因cTnT、Cx43，表现出成熟心肌细胞的特性13。然而，对于BMP_2诱导成体干细胞向心肌分化的机制尚不清楚。在胚胎干细胞研究方面，有人提出BMP_2可能通过Smad信号通路诱导胚胎干细胞向心肌分化8。目前已知，特异性转导BMP_2受体信号的Smad包括Smad1、Smad5和Smad816。我们先前的研究发现，MCSCs表达BMP_2的型和型受体，BMP_2可上调此两型受体的表达，故提出BMP_2通过其受体发挥诱导作用13。BMP_2通过与型受体结合使型受体激活，从

7、而使下游信号分子Smad的C端末两个丝氨酸发生磷酸化，由此启动Smad信号通路10。Smad转导BMP_2受体信号，通过促进多种心肌早期转录因子的表达使干细胞向心肌分化11。早期心肌转录因子Nkx215和GATA_4均为Smad蛋白的下游靶基因11。然而，对于BMP_2诱导MCSCs向心肌分化的受体下游信号转导机制目前还不清楚。本实验应用特异性识别p_Smad1P5P8的两个磷酸化位点（ser463和ser465）的抗体，观察到BMP_2在短时间内激活Smad1P5P8。磷酸化后的Smad1/5/8向细胞核内转移，1 h后几乎全部进入细胞核。Smad的磷酸化和核转位发生在相同时间段内。用SB2

8、03580抑制Smad的磷酸化后，Smad的核转位也被抑制。由此可见，Smad向核内转移依赖于Smad磷酸化过程。另外，本实验观察到，抑制Smad信号后，BMP_2诱导细胞GATA_4和cTnTmRNA的表达明显降低。我们首次发现，BMP_2主要通过Smad信号通路的介导作用促进MCSCs的心肌早期转录因子和心肌特异性基因的表达。结合以前的研究结果，我们提出BMP_2诱导MCSCs向心肌分化的可能机制为，BMP_2与MCSCs胞膜上的型受体结合，使型受体激活，引起下游Smad1/5/8与受体的胞内段结合，并发生磷酸化。磷酸化的Smad1/5/8与Smad4结合形成复合体，进入核内，直接与DNA

9、结合或与其他转录调节因子相互作用，从而上调Nkx215、GATA_4及cTnT等的表达，最终使MCSCs向心肌定向分化。在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中，Smad的磷酸化和向细胞核转位是Smad信号转导通路发挥作用的重要环节。在BMP_2诱导干细胞向心肌细胞分化方面，除Smad通路外还存在其他信号通路。Lee等14在心肌祖细胞系P19CL6的定向分化研究中发现，BMP_2能够激活PI_3K通路，进而增强心肌转录因子MEF2A和收缩蛋白MHC的表达。阻断PI_3K后，心肌终末分化被抑制。p38MAPK能增强心肌转录因子MEF2C的转录活性，还能提高AP_1的表达和它的DNA结合活性，从而促

10、进Nkx215的表达，促使P19细胞向心肌分化12。Smad通路和PI_3K通路之间、Smad通路与p38MAPK通路之间均存在相互交联13，14。本实验观察到，与诱导前相比，用SB203580抑制MCSCs的Smad磷酸化后GATA_4和cTnTmRNA的表达减少，但并未完全消失。在BMP_2诱导MCSCs向心肌分化中，除Smad信号通路外是否还有其他信号通路参与，有待于进一步研究。心肌梗死时，局部病变组织释放BMP_2增多15，骨髓中的MCSCs被动员入血液循环，迁移至心肌梗死区。在BMP_2的诱导作用下，MCSCs分化为成熟的心肌细胞，从而修复坏死心肌。深入研究Smad信号通路在BMP_

11、2诱导MCSCs向心肌分化中的作用，对于阐明心肌坏死后心肌修复的病理机制具有重要意义。MCSCs具有心肌特异性分化潜能12-15，依据Smad信号转导机制，在体外用BMP_2将MCSCs预处理后进行自体干细胞移植，或在MCSCs移植的同时注射BMP_2，对于心肌梗死的治疗可能具有良好的临床应用前景。3.人胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导分化干细胞可以直接填充和修复受损的心肌， 细胞移植是一个潜在可行的治疗心肌损伤的方法17。尽管一些自体干细胞， 如骨髓干细胞或骨骼肌细胞， 在免疫原性和伦理问题方面具有优势， 但成体干细胞非常少且很难分离。 胚胎干细胞（ESC）因具有无限增殖和多向分化的能力， 被认

12、为是细胞移植治疗心肌损伤最有希望的细胞来源。 目前为止， 一些研究表明， 人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞能移植到动物模型的心脏可与受体心肌整合17，18人类胚胎干细胞分化为心肌细胞的基本方法19-20一 般 为 两 种 : 一 种 是 用 内 脏 内 胚 层 样 （endoderm-like cell line， END-2）与人类胚胎干细胞共同培养21-13但这种方法因为动物产品引入可能会增加潜在外来病原污染。 Kehat 等人22首次报道了通过拟胚体形成方法， 以避免动物源细胞， 但这种方法也需要在培养体系中加入牛血清21，25。 此外， 一些试剂已被证实可以诱导或改善小鼠胚胎干细胞或骨髓基

13、质干细胞向心肌细胞分化， 如二甲基亚砜（dimethylsulfoxide， DMSO） 、视 黄酸 （retinoic acid，RA）30、骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic pro-tein-2， BMP-2）14，17，18， 但结果不一致。 Takahashi 等人22仔细筛选了 880 种化合物， 发现抗坏血酸（ascorbicacid）是唯一可以增加从小鼠胚胎或骨髓基质干细胞分化心肌细胞数目的试剂。研究旨在揭示牛血清添加在人胚胎干细胞向心肌细胞分化中是否必要。 筛选和比较了 3 个因素（维生素 C（ascorbic acid， AA）， DMSO， 5-氮杂

14、 2-脱氧胞苷（5-Aza-2-deoxycytidine， 5-aza-dC）在促进心肌分化中的潜能。 通过该方法， 旨在建立一个由PKU1。胚胎干细胞向心肌细胞分化的有效方法。 同时对分化的心肌细胞的相关标志物和基因表达以及细胞超微结构进行了验证。研究结果表明， 悬浮培养阶段含血清对人胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化具有关键作用。促进 PKU1。1细胞向心肌细胞分化的最强因子是在EB形成晚期联合添加维生素 C 和 5-aza-dC。 超过一半搏动细胞团的搏动频率类似于成人心脏搏动频率， 并持续最长可至 194 天。 相关心肌细胞标志物、基因表达和超微结构均证实了诱导分化的心肌细胞特征。4.抑制 NHE1 活性对干细胞向心肌分化的影响心血管障碍造成的心肌缺血会直接导致局部心肌细胞受损， 影响心脏正常功能。采用细胞移植疗法对受损心肌细胞进行修复， 是目前干细胞和再生医学研究的热点之一。采用肌肉祖细胞31、胎儿心肌细胞或骨髓间充质干细胞进行细胞移植的研究已有报道， 但由于这类细胞向心肌细胞分化的潜能有限， 很难作为理想的移植细胞用于临床应用。胚胎干细胞具有多分化潜能并可以在