MTT法绘制生长曲线Word格式.docx

1、 1，5%FBS-L-DMEM, 5x104个/ml细胞悬液，5mg/mlMTT溶液，DMSO,0.01M PBS, 2, 96孔板共7个,酶标仪,50ml离心管，1.5ml离心管，0.22m滤膜，锡箔纸，MTT工作液（1ml/管）实验步骤：1， 分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200l细胞悬液进行培养（每孔1x104细胞）。2， 培养16-48后，每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20l，37继续孵育。3， 孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，此时应该倾斜96孔板，用枪头小心的将上清液

2、吸去，不可吸去下面的结晶颗粒，慢慢吸去。每孔加入150lDMSO,室温振荡10min，使结晶充分溶解，于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。注意事项：【1】 1, 两种方法分离小型猪骨髓间充质干细胞的比较分别取两组0,1,3代细胞，制成1x103的细胞悬液，接种到96孔板，每孔细胞悬液200微升，置37、5%CO2饱和湿度孵箱内孵育，各组每24小时分别取出4孔，每孔加入MTT（2mg/ml）20微升 37孵育，4h后吸弃孔内培养液，每孔加入150微升分析纯的二甲基亚砜，移至酶联免疫检测仪上振荡10min,用分光光度计在492nm波长处测定每孔的吸光度值（OD492），以OD（492）

3、值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线【2】 来自：SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究大鼠MSCs生长曲线测定：为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况，对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养。分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20l，37继续孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入150lDMSO,室温振荡10min，使结晶充分溶解，于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。在酶标仪上选择570nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度（A）值，连续测7天，以

4、时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。来自：2003人骨髓间充质干细胞的分离培养及部分生物学特性的实验研究2007贴壁法培养大鼠的骨髓间充质干细胞大鼠骨髓间充质干细胞移植促进皮肤创伤愈合的研究（3）接种细胞时，尽量混匀后再接种，尽量保持每孔细胞数接近（4）为防止96孔板的边缘效应，最好在实验组留出一空孔，内加平衡盐溶液，或者培养液以维持适当湿度，减少实验误差。（5）加入MTT时每孔加入量很少，通常是10-15微升，不宜准确定量，可以事先算好要加入的培养液总量，以及所需MTT量，混匀后再加入培养孔内。（6）加入MTT时，建议熄灭酒精灯，配置好的MTT应避光冷藏，一周内用完，最好在加入MTT前换一次液。（7）在进行检测期间需要换液，换液时最好不用PBS洗，这样会损失紫色结晶，可以将96孔板拿掉铺几张滤纸在其上，小心将板翻过来，孔中液体会流出来，且不会损失，肉眼可见的结晶，加入MTT溶解液后，上下吸收可以完全溶解甲簪。（8）为了防止板来回移动对细胞的影响，因此，把需要测得的孔，做完所有操作后吸出来，放在一个外面用的酶标板里，然后上机检测。 （9）MTT对菌很敏感，所以整个过程都要无菌。保存在-20 ，防止反复冻融，保存到4最多一周。一旦变为绿色应禁止使用。 （10）加入DMSO前需要去掉原培养液，但是去掉原培养液就怕会丢失结晶，因此