生化实验思考题参考答案文档格式.docx

1、 （3） 化学与生物化学方法：包括溶胀法、酶解法、有机溶剂处理法等。实验二 总糖与还原糖的测定1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优缺点？答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测薄层层析玻璃板或塑料板分配、吸附上行较大较高柱层析玻璃柱分配、吸附、离子交换、分子筛、亲和层析等下行可小可大高效液相层析不锈钢柱-高实验八 蛋白质含量的测定（1） 简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及优点。原理：由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含

2、量呈正比关系，可用作定量测定。优点：迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。实验十 影响酶活性的因素（1）本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反应快慢的？在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，经过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：淀粉紫色糊精红色糊精麦牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。因此反应后颜色如为蓝色说明酶活力低，淡黄色则说明酶活力高。（2）如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反应快慢的？淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反应。麦芽糖、葡萄糖是还原糖，与本

3、尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。因此，产生红棕色氧化亚铜的沉淀越多说明酶活力越高。（3）通过本实验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响的？温度、pH、激活剂、抑制剂等。高于或低于最适温度或pH，酶活力都会降低；激活剂和抑制剂不是绝对的，只是相对而言，随着浓度的变化而变化。实验十二 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定（1） 试说明用硫酸铵分级分离酶的方法及应注意的事件。用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。例如：某酶（或蛋白质）发生盐析的范围为35-65%

4、饱和硫酸铵的浓度，因此可先选择30%饱和硫酸铵浓度，去沉淀杂蛋白，然后选择70%饱和硫浓度酸铵，留沉淀（含所要的酶）。注意事项：在用硫酸铵沉淀酶蛋白时，要注意缓冲液的pH值和温度，盐的溶解度随温度不同而有较大的变化，同时酶的溶解度亦随温度的改变而改变。在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。（2） 用正丁醇处理匀浆液可以有效地使碱性磷酸酶酶蛋白释放，使酶的产量大大提高，这是为什么？因为碱性磷酸酶酶是一种膜蛋白，正丁醇处理后可使结合在膜上的蛋白质更多地释放出来。（3） 酶活力测定时，为什么必需先将酶液对缓冲液

5、透析后才测定？去除盐离子的影响。实验十三 凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶1.在本实验中要注意哪些重要环节？1）注意区分柱子的上下端。2）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。3）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此凝胶。4）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。5）核酸蛋白检测仪，记录仪，部分收集器要正确连接。6）要控制一定流速。7）收集得到的液体要进行酶活力的检测。实验十四 底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）1.在测定酶催化反应的米氏常数Km和最

6、大反应速度Vm时，应如何选择底物浓度范围？底物浓度选择范围 S0.2-5.0 Km为宜。底物浓度选取还应该注意其倒数能均匀分布。1/v 1/v 0 1/S 0 1/S 底物浓度太大 底物浓度太小2.试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。 （1） Km是酶的一个极重要的动力学特征常数， Km物理含义：ES络合物消失速度常数与形成速度常数之比；其数值相当于酶活性部位的一半被底物占据时所需的底物浓度。（2） 可根据Km估计底物浓度的水平。（3） Km可作为同工酶的判断依据。（4） 鉴别最适底物。（5） 有助于在酶学研究中对底物浓度的选择。选用S10Km浓度进行活力测定 3.为什么说米氏常数Km是

7、酶的一个特征常数而Vm则不是？某种酶的Km在给定的体系中不随酶浓度改变而改变，也与酶的纯度无关，因此是酶的一个特征常数。但Vm随酶浓度改变而改变。实验十七 SDS-PAGE电泳（1） 简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理;1）SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质SDS复合物。 2）SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使SDS与蛋白质的复合物都带上相同密度的负电荷。 3）SDS-蛋白质复合物在水溶液中的形状一样，都是近似于雪茄烟形的长椭圆棒。 4）不同的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，并具有相同

8、形状；因此在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数。（2） 是否所有的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定得到的分子量都完全可靠？不是。 如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。 例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。实验十八 维生素C的定量测定（1）简述本法测定VC的利与弊。碘量法测定VC相比其它方法传统的碘滴定法迅速、简捷，但易受到待测物颜色干扰而不易判断滴定终点；只能测定待测溶液还原型的Vc含量，如果溶液中还含有其他还原型较强的物质会影响测定结果；而且待测的还原型Vc易被空气氧化影响滴定结果。（2）为何以显蓝色在30s内不褪色为滴定终点？因为本方法是根据氧化还原反应测定的，待测的的溶液中可能含有其他比Vc还原性低的物质，也能使碘分子被还原，使蓝色褪去，如果把这部分还原物质所消耗的碘液计算进去，会照成误差，因此以显蓝色在30s内不褪色为滴定终点。