RTPCR实验步骤Word文件下载.docx

1、b ：Oligo dT-Adaptor Primer ;和c：特异的下游引物。如果用 a和b方法, 是扩增的所有的 cDNA （理论上），还要用此产物做 PCR 的模板继 续扩增。如果用 c 方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做 RT-PCR 遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因， 结果从一种组织中可以扩出我的目的基因， 条带非常的好， 而另一组 织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带， 尝试其他条件同样无 法得到满意的结果，百思不得其解！ （注：已肯定该基因在两种组织 中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的 RNA 的量是不一样的，我测过吸光度，

2、差异 还很大，会不会和这有关呢？ 请高手指教！解答：1.RT-PCR 有两种做法：条件具备的话可用 kit 进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步 进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异 性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行， 当然也可能是我买的 kit 不太好。（ promega ）。2.RT-PCR 应具备的条件高质量的RNA （保留后可做5 ，3 RACE）;引物的（最好产物 短点） ；若涉及粗略定量的话还应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓 度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将 RNA 的浓度以 及内标分子的表达量调整的

3、完全一样）;体系的均一性等。3.RACE我做过 RACE（ 3 RACE 是宝生物的 Kit ； 5 RACE 是 Gibico）， 但现在再进行另一个同源基因的 3 RACE 时却怎么也 P 不出来，这 两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（ RACE 的方法），而另一个基因的 3 UTR 却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的 3 UTR 太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR 的常用内标 b actin 和 GAPDH 的使用有选择性吗？比如 不同的细胞，不同的刺激。有关内参：RT-PCR 内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好 分开两管， 把除了引

4、物之外的 mixture 统一配，拍照后，算目的基因 和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同一管的 PCR，内有act in和目的基因引物。虽然 可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、 Mg2+ 加倍）。 请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess theamount ot the template（for RT

5、 and PCR） and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using accurate piptte is wrong. itshoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT,其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶 本来就是过量的A-A ,（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq 酶的，半斤八两就可以了，我想

6、这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg 就跟不能变了，一变整个体系就变了。 能看到均一条带就很好了。 关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是 摸上 3、5 摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的 好了，还要考虑比较的不同的模板中的量， 所以我们不建议再同一管 中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几 封帖子里都谈了，再说一边我得观点， 1 、半定量和定量 RT-PCR 做 的都是基因相对表达量， 不是绝对表达量， 除非

7、你能准确知道来自多 少细胞，但是细胞还有死的呢。 2、以电泳为基础的半定量 RT-PCR 本身是不可信的， 作为实验的粗筛是可以的， 但不能作为最终结果的， 3、半定量 RT-PCR 应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表 达相同，长度差不多， GC 含量相似，或者实在穷的要省 PCR 管和 taq 。关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧 2 的冥和 2 的倍数是相同的。 看上去任何一个时期都可以， 实际上是不 对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的 文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那 些，但是其中主要是因为模板引物酶原

8、料和 buffer 之间的关系，这 种反应单靠改变其中一种成分没有用的， 酶一直是过量， 再加酶也没 用，引物 ntp 都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是 要在你的凝胶成像分辨范围内， 所以选一个这两种的契合点。 给你一 张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在 * 帖过。 关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内 含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用 于基因组PCR）、长度小于500bp 600bp等等。引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的， 要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这

9、样任何几个都可以拿来披，也不用查。我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因 在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了， 怎么考虑内含子的问题呢？18s的引物也和著名的B act in 样是设计的，只要拿到序列就可以了, 但是限制是只能用总 RNA 为模板，但是比 actin 和 bubulin 等可准 多了，更不要说 GAPDH 这个破烂了。 18s 除了在细胞中更相同（量） 外，主要是它占的比例远远高于看家基因， 所以定量更加准确， 我想， 不知对不对，请几位主任和 eeflying 指教。我认为，就像你用某一 种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，

10、说一座房子是由 2000 块砖造成的，比说又 29 根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看 家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看 懂使用的那条序列，不知有没有人用过， 告知其序列和 genbank 号。 正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的 actin 的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。有那位高手用过 18s 的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列） ？ 原位杂交最好用 RNA 做探针，效果好一些，反正你有钱卖 roche 的 盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是 了

11、。正义反义也容易理清。我觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条 ,许多 专业书都有详细的描述 ,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得 不出结果。因此， 我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同 等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性 ,我的以下经历说明： 做实验时各人的情况不同 ,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的RT PCR时，按常规方法，提取总RNA后，首 先用自己设计的下游引物进行逆转录， 不断改变反应条件，进行了N 次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位于我们实验 另一位同学克隆的片断当中， 而该同学已经用 RT-PCR 克隆出

12、她的片 断（尽管她用这些RT PCR产物做模版再进行PCR时也没办法 重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断， 然后用她的RTPCR产物作模板 （有点改进，逆转录反应换用了9 mers随机引物），用我的引进物进行一般 PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以 说明实验可以有自己的模式， 书本的知识和别人的经验很重要， 但有 时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1引物的特异退火温度怎样设定？可以根据 gc 和 at 含量算出吗？ 可以用引物报告单上的 Tm 值吗？2PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适？ M

13、gCl2 应加多 少？各个成分的量有无确定标准？3PCR 结果跑电泳， actin 有，但跑不出目的条带，有几种原因？与 cDNA 的量少有关吗？ Mg 离子太多是否会抑制 Taqase 的活性？一般来说引物报告单伤得是对的 ,也可以自己算 ,实际上重要的各条引 物一致 ,剩下的可以摸的 .20 中是指体积还是量 ?只要不明显改变体系的离子强度 ,加 1,2ul 都可 以的 .mg 要调的 ,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎 ,我都是常年不变 的.如果内参照有 ,目的没有 ,至少证明不是 美丽惹的祸.原因书里应该都 说了.在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA 。而实验 失

14、败的主要原因是核糖核酸酶 （RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛 存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而 RNA 制剂中只要存在 少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过程中的降解，而所制 备的 RNA 的纯度和完整性又可直接影响 RNA 分析的结果，所以 RNA 的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染；另一方面要最 大限度地抑制内源性的 RNA 酶。 RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活， 如煮沸、高压灭菌等。外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘 中。在其它分子生物学实验中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外 源性的

15、 RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人 员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的 RNA 酶。一、 防止 RNA 酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均应在使用前于 180 C的高温下干烤6hr或更长 时间。2.塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗 （注意：有机玻璃 器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干 燥，再浸泡在 3% H2O2 室温 10min ，然后用 0.1% DEPC 水冲洗， 晾干。4.配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在37 C处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22阿 滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置 RNA 操作专用实验室，所有器械等应为专