分子生物学实验技术实验内容概要Word格式.docx

1、注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6hr或更长时间。2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。（二）反转录每人做一管。反应体系（20l）：按下列顺序加样5Buffer4ldNTPs6lRNA酶抑制剂1lOligo（dT）随机引物反转录酶AMV提取的RNA总体积20l反应条件：4

2、2 1h1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20，以防酶失活。（三）PCR反应体系（50l）：ddH2O32.7l10PCR Buffer5lP12lP2Taq0.3lcDNA templateTotal50l反应程序： 预变性 94 2min 变性 94 30s 退火 50 45s 延伸 72 1min 30 cycl

3、es 终延伸 72 10minPCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳1、 电泳缓冲液TBE（10）的配制：称取Tris-base 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA（pH8.0） 20ml，定溶至1000ml。2、 1.5%琼脂糖凝胶的配制：称取1.5g琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10TBE缓冲液，并加水定容至100ml，加热溶解后加入5l EB（10mg/ml），摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。3、 电泳检测：取PCR产物5l与Loading Buffer 1l混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5l DL2000 DNA Marker作

4、对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。1、 EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。2、 禁止将盛有EB的器皿随意乱放，且不要戴有EB污染的手套随意拿其它无EB的试剂或仪器。（四）PCR产物的纯化每两人的PCR产物合并后作为一管，用PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）回收目的DNA。1、 PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好重量的空1.5ml Ep管中。2、 将装有胶粒的Ep管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。3、 按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer，

5、置于5565水浴中约7min，其间要摇动Ep管23次，使胶粒完全溶解。4、 将上述溶胶液加入到HiBind spin-column中，10000g离心1min，弃去收集管中的液体。5、 加入300l Binding Buffer，100006、 加入750l SPW Buffer，静置2min，100007、 重复步骤6。8、 空管10000g离心1min，以弃去DNA回收柱中的残余液体。9、 将DNA回收柱放入新的1.5ml Ep管中，并加入30l DNA Elution Buffer至膜的中央，10000g离心1min，以收集纯化的DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于20保存。1、 电泳时应换

6、用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液pH升高而降低DNA的产量。2、 在切下含目的DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜（如一次性手套），使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。3、 切胶过程要尽可能短，防止DNA在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。4、DNA的洗脱效率与Elution Buffer的pH有关，因此用ddH2O洗脱DNA时，应调节ddH2O的pH值至8.0。二、基因的克隆（一） DNA片断与载体的连接本实验做PCR回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。TA克

7、隆原理：利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR产物的克隆和测序。每两人做一管。反应体系（10l）：Ligation Solution I 5lPCR回收产物 4.5lpMD-18T vector 0.5l总体积 10l16 4h以上（二） 感受态细胞的制备试剂配制：1、 LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone） 10g，酵母提取物（Yeast extract） 5g，NaCl 10g，溶于800

8、ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。2、 0.1mol/L CaCl2溶液：称取1.11g CaCl2（无水，分析纯），溶于超纯水中，定容至100ml，高压灭菌或0.22m滤膜过滤除菌。3、 无菌甘油：取甘油100ml，高压灭菌即可。操作步骤（无菌操作）：1、 从生长有大肠杆菌DH5的平板上挑取一个单菌落，接种于2ml LB液体培养基中，37 200r/min振荡培养过夜，作为一级种子。2、 将一级种子按1:50比例无菌转接到5ml LB液体培养基中，37 200r/min振荡培养约2h-3h，至细菌的OD600达到0.5左右。3、 在无

9、菌条件下将细菌转移到一个无菌的1.5ml Ep管中，冰浴30min。4、 4 4000 r/min离心10min，弃上清。5、 加入1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，继续冰浴15min30min。6、 4 4000 r/min离心10min，弃上清。7、 沉淀中加入200l用冰预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻重悬。悬浮的感受态细胞可直接用于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为15%，分装100l/管，-70保存备用。1、 细胞生长状态：不要用经过多次转接或储存于4的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中取适量在LB固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌

10、种。2、 细胞生长密度：以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5菌株的OD600为0.5，细胞密度在5107个/ml左右（不同菌株情况有所不同）时比较合适。密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。3、 试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是高纯度的（AR.），并用超纯水配制，最好于-20分装保存。（三） 连接产物的转化每人做一份。1、 氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：用灭菌的ddH2O将氨苄青霉素粉配成100mg/ml水溶液，经0.22m滤膜过滤除菌后，置-20保存备用。2、LB液体培养基（Amp）：在LB液体培养基中加入1l 100mg

11、/ml的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。3、LB固体培养基（Amp）：在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸气灭菌20min。待培养基温度降至50左右，加入1l 100mg/ml的氨苄青霉素母液后，铺制平板。待培养基凝固后，于4保存备用。1、 取-70冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5l，轻轻混匀，冰浴30min。2、 42水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。3、 加入400l LB液体培养基，37 200r/min-220r/min振荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。4、 4 4000r/min离心5min，弃去上清400l，将剩余的100l菌液混

12、匀后涂氨苄平板，37培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h16h，至单菌落出现。1、 质粒的浓度：转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。2、 在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。3、 同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2：以质粒代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生

13、素的LB平板上应出现大量菌落。（四） 质粒的抽提每人抽提一管，采用质粒快速提取试剂盒进行。实验原理：本试剂盒所带Resin质子化以后，具有在高盐、低pH值情况下吸附DNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA的性质。试剂组成：1、离心柱（50个）：柱上含Resin（树脂），最大吸附量15g，4保存。2、溶液A（0.6m1）：RNase A 10mg/m1，-20保存。3、溶液B（9m1）：50mM Tris/HCl，10mM EDTA，10mg/m1溶菌酶，pH 8.0，4保存。4、溶液C（18m1）：1SDS，0.2M NaOH（室温低于15时会有沉淀析出，加热溶解即可）。5、溶液D（24m1）：4M盐酸胍，0.75M KAc pH4.6。6、溶液E（12ml）：洗液（用时加入9