表观遗传甲基化Word文件下载.docx

1、泌尿系肿瘤；早期发现；DNA甲基化；尿液检测如果早期发现，泌尿系的三大肿瘤是可以手术治愈的。我们旨在验证新的DNA甲基化生物标记物与这三种泌尿系肿瘤的关系，从而成为潜在的非侵入性检查。在评估药物细胞和组织样本后，我们创造了一组基因表达的目的基因系列，2个目的基因被用来做进一步研究。在12个癌症细胞株和318份临床病理样本中量化这些基因的甲基化水平。PCDH17和TCF21甲基化水平在膀胱癌、肾癌以及前列腺癌中的敏感度分别为：92%，67%和96%。甲基化水平在这些癌症个体中的差异性很大，显示了83%的敏感度和100%的特异性。引言泌尿生殖器癌症，主要是前列腺癌，膀胱癌，和肾肿瘤，包括了异构体恶

2、性肿瘤中显著的发病率和死亡率。总体而言，据估计前列腺，膀胱和肾脏肿瘤全球确诊2008年1571483新病例是，代表人类第二个恶性肿瘤系统，仅次于肺癌。2010年，在美国，泌尿系统癌症患者构成恶性肿瘤的最常见和最致命的肿瘤系统，约总计59770人死亡。该系统肿瘤在西方世界不断上升，这些癌症发病率表明泌尿生殖系统肿瘤将继续成为未来一个显著造成人类健康的负担。然而如果及早发现，这些癌症是可以大部分通过手术切除是可以治愈的，但由于在早期缺乏具体的准确的特异性临床表现，只有通过影像学以及穿刺活检以区别良性疾病，这就为我们提出了一个真正的挑战。此外，对于一些高危人群的健康筛查（例如老年男性、吸烟史、职业性

3、因素长期接触致癌物质等人群），提供一些非侵入性健康筛查方法，为早期检测成为可能，这些检测具有显著的临床意义。 癌症的发展及细胞的克隆演变是由遗传及后天共同影响的，这些细微的变化可以在早期从体液及组织活检中发现。这些变化早期即可在分子水平上存在，因此是可能被检测到，在肿瘤通过尿细胞学检查、膀胱镜、影像学检查以及常规病理组织活检被确诊。可能肿瘤仅仅在器官的某一小部分团块中发生。大量的基因甲基化在肿瘤中被报道：膀胱肿瘤（SOX9,RARB,GSTP1，MGMT,ARF,CDKN2A;敏感性约56-95%；特异性约71-100%），肾肿瘤（PTGS2，RASSF1A,RARB,敏感性为31-77%，特

4、异性为75-91%），前列腺癌（TFAP2E,HIST1H4K,GSTP1;敏感性为47-92%，特异性为76-100%），在这些潜在具有诊断意义的生物分子标记物中，一些具有较高的肿瘤特异性，例如前列腺癌的GSTP1，膀胱癌的TWIST1，NID2，GDF15，TMEFF2以及VIM基因。尽管候选基因在肾细胞癌中特异性甲基化明显缺乏。由于在尿液标本中肿瘤细胞缺乏的问题，因此有限的DNA限定量仅仅可用于分子检测。因此那将是有利的确定一系列的基因甲基化水平，可以准确的早期检测泌尿系三大恶性肿瘤。然而，一些额外的基因系列甲基化水平减少他们的误差。非侵入性的尿液样本检测似乎是体液中的一个非常明智的选择

5、并且可以别常规应用，以代替目前使用的常规检测方法，而这其中的有些基本上市不准确的、并且十分昂贵。在以前的研究中，我们已经使用外延的组合策略细胞系的遗传药治疗后的微阵列基于表达分析，并比较了重新表达的基因与那些被下调在rele-的原发性肿瘤相关患者组。通过严格的标准，我们能够选出在膀胱癌以及大肠癌中出现甲基化的候选基因系列。在本研究中，我们将进一步使用基因甲基化检测方法检测膀胱癌、肾癌以及前列腺癌在组织以及尿液标本中的甲基化水平。结果鉴定出一系列在泌尿系肿瘤中甲基化的基因组。我们分析了泌尿系统不同的肿瘤之间未使用5-氮芥以及TSA处理过的芯片组，利用了对DNA脱甲基化的协同作用。系列基因中在所有

6、泌尿系肿瘤中通过DNA甲基化检测检查发现肿瘤组织中的甲基化过度表达是正常组织的4倍。泌尿系肿瘤中甲基化位置存在于CpG岛及位于启动子区附近的转录起始位点。此外，以排除了一些已被标记的印迹基因和其他表达不佳的基因。因此，第一组前20个基因被证明是对于泌尿系肿瘤较好的潜在候选基因（见表1），其中PCDH17以及TGF21被认为是同时在此三种肿瘤中表达的潜在的候选基因。新颖的启动子甲基化状态的亚硫酸氢盐测序候选基因。PCDH17启动子甲基化状态和TCF21通过在亚硫酸氢盐测序在未接受治疗的泌尿系肿瘤的细胞系中被证实（图1）。除了用于TCF21基因甲基化在LNCaP细胞中所分析的第一10 CpG二核苷

7、酸，利用封闭完全甲基化的亚硫酸盐测序观察CpG岛的甲基化状态或仅仅观察到部分甲基化位点。这些电泳允许相关的后续分析选择合适的CpG二核苷酸。新奇目的基因在图表中的甲基化地位。所有未接受治疗的泌尿系肿瘤细胞系均被发现了PCDH17或者TCF21的基因甲基化，尽管仅仅在一些程度上。在接受5-氮芥或者TSA治疗后，一个相当大的DNA甲基化水平呈现出来。CpG岛甲基化与转录基因沉默之间的联系。泌尿系肿瘤细胞株对于PCDH17以及TCF21基因之间的甲基化显示了低的或者缺乏转录表达。因此，一些未接受治疗的肿瘤细胞在出现甲基化中缺乏TCF21基因表达（如5637，J82，SCaBER，7860，Caki-

8、2,22rvl，LNCaP以及PC-3）。在未接受治疗的肾细胞癌细胞株中，一个边缘显著逆相关性之间TCF21甲基化和表达水平相关（r =-0.95，p值=0.051）中被发现。在图所示的ACHN启动子去甲基化状态之后，利用5-氮芥的DC单独治疗或者联合TSA治疗，基因表达被恢复或者被升高。一般来说，PCDH17和TCF21重新表达水平当癌症细胞暴露于后生调节药物的组合，显示出基因启动子的甲基化之间的关联，降低表达水平的候选基因和它们甲基化状态潜在的诊断组织样品中。评价组织样品中甲基化状态如下进行定量MSP检测。使用预先定义的经验截止值（表3），PCDH17被甲基化在48，61和60BLCA，R

9、CT和前列腺癌，分别为，而对于TCF21各自的甲基化频率分别为92，61和对于BLCA，RCT，和前列腺癌（图2）96。在定量的差异癌症患者和无癌之间略去甲基化水平个人是两个基因BLCA统计学显著而前列腺癌，但不是在RCT（曼 - 惠特尼，P 0.001）。然而，当为两大亚型进行这种分析，RCT（肾透明细胞癌和乳头状肾细胞癌，占90的RCT的），正常和癌变组织之间的差异显著是明显的（p值=0.001 PCDH17，且p= 0.007对于TCF21）两种基因同时检测体现出了极佳的泌尿系肿瘤检出特异性以及敏感性。值得注意的是，TCF21甲基化水平检测敏感性超过90%的片段显示了早期以及较低级别的膀

10、胱肿瘤以及前列腺癌。而且，增加PCDH17甲基化检测提升了肾细胞癌以及前列腺癌的检出率。对于两种基因的ROV曲线分析，显示了低于该曲线的区域，0.977（95% CI,0.941 - -1.000,p 0.001）,0.758（95% CI,0.609 - -0.906,p = 0.066）,和0.963（95% CI,0.901 -BlCa 1.000,p 1.000），考虑为个别随机误差以及个人成分原因。评估以上两种基因生物标记物在肿瘤患者尿液中的甲基化程度。评估的性能面板在尿液,甲基化水平在一个独立的验证组即尿沉积物接受于健康的捐赠者、膀胱肿瘤患者、前列腺癌患者以及肾癌患者。然而，TCF

11、21在尿液中的甲基化水平在膀胱肿瘤患者中较其他泌尿系肿瘤患者中的甲基化水平明显升高，因为该基因在膀胱肿瘤中广泛表达。表3描述了使用这两种基因在尿液中进行甲基化检测发现膀胱肿瘤、肾细胞癌以及前列腺癌的有效性。这些在尿液中检出肿瘤生物分子标记物显示出膀胱肿瘤的检出率明显高于前列腺癌以及肾细胞癌。ROC曲线分析显示AUC 0.791（95%CI,0.701 - -0.881,p 0.701）,0.656（95%可信区间,0.548 - -0.764,p =0.008）,和0.650（95% CI,0.523 - -0.778,p = 0.030）,BlCa分别个随机对照试验和主成分分析（图4）。总体

12、而言,这些生物基因标记物有能力检测三个主要泌尿肿瘤敏感性为39%和100% 特异性和各自的ROC曲线分析显示了AUC为0.632（95% CI,0.549 - -0.715,p = 0.006）中单一的空心尿液样本（图4）。讨论：膀胱、肾和前列腺癌,占一个全球泌尿系癌症较大的发病率和死亡率，并且再早期大多数无明显临床症状，在此时期有效治愈的可能性很高。虽然这些都是不同肿瘤的临床、病理、遗传和治疗的角度来看,但是它们均有可能在早期向尿液中释放细胞，这就为尿常规检测这项无创检测成为可能。结合这些基因表达微阵列分析,表观遗传特征和表达分析确定了两个新颖的潜力候选基因genes-PCDH17 TCF2

13、1，随后在组织和尿液样本进行验证。最常见的泌尿系统癌症筛查是一项复杂的任务。筛选的利益受到了挑战，其中主成分分析由于公认的缺乏总体存活率的影响，相当大的比例主成分分析检测到血清PSA筛查。然而,症状出现几乎到了疾病的中晚期,在这这种阶段,发病率和死亡率很高。相对于前列腺癌的患者膀胱肿瘤的普遍性则较低，高达80%的表面阳性具有良好的预后。然而，这些中的许多将产生许多临床症状，并且这些中的许多临床症状，并且具有很高的破坏性，浸润性很深的膀胱肿瘤具有很高的致病性和致死率。尽管血尿是膀胱肿瘤中的一个很普遍的临床表现，但是特异性不高，并且常常出现在疾病晚期。因此怀疑膀胱肿瘤的患者必须接受膀胱镜这一有创性

14、的检查。尿细胞学检查常常用来对于膀胱肿瘤的筛查，因此对于低级别和早期的膀胱肿瘤患者具有较低的敏感性。类似于膀胱肿瘤和前列腺癌，肾细胞癌的患者在早期也无明显临床表现，约20-30%的患者在确诊时已经发生局部浸润以及转移。超声用于健康普查增加了早期肿瘤的诊断，防止了早期肿瘤向晚期恶变的进展。然而，有效并且准确的肾细胞癌的早期检测（超过90%的治愈率）目前并没有有效利用。因此发展有效的早期检测手段用于泌尿系肿瘤的早期诊断是十分必要的。之前，已有文献报道使用前列腺癌、肾癌、膀胱癌患者体液进行DNA甲基化检测进行肿瘤的早期发现，但是此三种泌尿系肿瘤的基因甲基化检测之前并没有被证明，因此，本项研究将首次进

15、行此项尝试。因为尿液标本中经常包含一小部分细胞，因此定量进行DNA的甲基化检测，使用这两种基因将变得显而易见。而且，此项实验在大量的泌尿系肿瘤临床样本中被证明，它将成为更加有效和更加经济的肿瘤筛查方法。因为大多数个体被卷入了一个不能揭示肿瘤的筛查项目之中，一项更加积极有效的检查将直接排除掉其他诊断程序，从而减少了花费。高度普遍的PCDH17和TCF21基因在泌尿系肿瘤细胞株中的甲基化检测被认为是有效的在大多数原始肿瘤组织中，相当高比例的膀胱癌和前列腺癌患者以及一部分肾细胞癌患者被证明这两种基因甲基化检测阳性。更重要的是，在正常膀胱和前列腺组织中DNA的甲基化水平十分低，从而被认为是合理的肿瘤分子标记物。然而，我们发现DNA甲基化的差异在肾细胞癌组织和正常肾组织中并不是十分大。因为肾细胞肿瘤是一类异基因种类的肿瘤，其中ccRCC和pRCC占肾肿瘤的90%。显著地，在ccRCC、pRCC和正常肾组织中比较PCDH17和TCF21的甲基化水平，如果三者之间有十分巨大的差异，就可以证明其可以用来充当生物标记物。这些结果与我们之前在肾细胞肿瘤中的发现相一致，证明肾细胞癌与嗜酸性细胞瘤类似，产生了类似于正常肾细胞的生物学效应。尽管在进行甲基化标记物的寻找中我们发现了可以区