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1、 职称： 评 阅 人： 职称： 2005 年 6 月高效液相色谱法分离与测定柴胡中的柴胡皂甙学生：导师：摘要：中药柴胡为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，具有解热镇痛、利胆保肝等作用。柴胡中的柴胡皂甙a和柴胡皂甙d为其有效成分。本文采用反相高效液相色谱法对北柴胡中的柴胡皂甙a进行了分离和测定。选择出分离的最佳条件：流动相为90%乙腈+10%水，流速为0.8mLmin-1，检测波长为208nm，在0.051.50mgmL-1范围内柴胡皂甙a的含量与峰面积线性关系良好，回归方程为：Y=2258428X+186676，相关系数R=0.9993，检出限为2.3ngmL-1，回收率为100.5%,分离效

2、果良好。关键词：柴胡，柴胡皂甙a，HPLC，分离，测定Determination of the Saikosaponin a in BupleurumRoot by HPLCCandidate:Advisor:Abstract:Chair-hu, the root of Bupleurum Chinense DC or Bupleurum scorzonerifolium Willd, is a popular traditional Chinese drug. It has been used in medical treatment for over 2000 years and has

3、been primarily used to treat fever and chill in turn. In this paper, Saikosaponin a and saikosaponin d, which were verified as bioactive compounds in chair-hu, are investigated using reverse phase high-performance liquid chromatography （RP-HPLC） with UV detector. The best conditions of the experimen

4、t were chosen The components of mobile phase are 90% acetonitrile and 10% water, while its flow velocity is 0.8 mLmin-1. The detecting wavelength is 208nm. A best linearity of signal and the concentration of saikosaponin a standard substance was obtained when the concentration of saikosaponin a,is b

5、etween 0.05mgmL-1 and 1.50 mgmL-1, the regress equation is Y=2258428X+186676, and the correlation coefficient is 0.9993. The determination limit of Saikosaponin a is 2.3ng mL-1, the recovery is 100.5%. Satisfactory results were obtained in the sample determination.Key words: Chair-hu, saikosaponin a

6、, bioactive compounds, HPLC目录第一章 前言1.1 中药的起源与发展中医药源远流长，它的发现与应用经历了长期实践的过程。原始时代，我们的祖先由于采食植物和狩猎，接触并了解到某些植物和动物具有一定的治病作用，经过无数次的试验、观察、口尝身受等，慢慢积累起一些运用中草药的知识。唐代李绩、苏敬等主持编写了最早的一部药典学著作新修本草（又称唐本草），比起1542年欧洲纽伦堡药典来，要早出800余年，对医学的发展作出了重要的贡献。虽然现代医学非常发达，但是中药的药效缓和、副作用少，经过数千年的医学实践证明确实有效。用中医药治病，不是“头痛医头、脚痛医脚”，而是把全身作为一个整体

7、，综合治疗，全面地解决问题，因此具有其特殊性。随着生产力的提高，如今中医药也采用现代科学的理论和方法进行研究，如动物实验、组织病理学观察、药物化学成分分析等。服食中药已不再以煎煮草药为主，而是出现了药片、胶囊、浸膏液、糖浆等剂型，使服食中药变得省时省事、简单方便。目前已经鉴定且有学名的中药已达8千余种，而常用的中药有500多种，包括植物药、动物药和矿物药，其中绝大部分为植物药。近来，随着现代工业的飞速发展，我国的中药生产状况大有改进，截至2004年，中药产值比1979年翻了五番，占医药工业产值的40%以上1。中药制剂工业生产中的重要步骤是中药有效成分的提取和分离，只有将有效成分提取出来并加以纯

8、化，才能对这些化合物的各种性质和功能进行全面研究，这些直接关系到中药制剂的质量、疗效和产量。1.2 中药有效成分及其分离纯化的研究现状现代研究结果表明，中药的有效成分主要是生物碱、黄酮、苷类、酚类、甾类、蒽酮、木质素、有机酸、氨基酸、多糖、蛋白质、多肽酶、挥发油以及萜类2。至今为止，研究的主要对象集中在生物碱、皂苷、黄酮、多糖、蛋白质类成分上。在中药有效成分的分离方面，有文献记载3.4的分离方法有：（1）系统溶剂分离法 一般是将皂甙总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。利用柴胡中各化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化。（2）两相溶剂萃取法 萃取法：两

9、相溶剂提取又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。 逆流分配法：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。 液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成两相，并可生成有效的液滴。（）铅盐沉淀法 利用中性醋酸铅或碱式醋酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶的铅盐或

10、络盐沉淀，而用于分离中药成分。柴胡皂甙一般用碱式醋酸铅。通常将铅盐沉淀滤出，然后将沉淀悬于水或者稀醇中，通入硫化氢气体或加入硫酸钠等试剂进行脱铅，即可回收提取物。（）盐析法 盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。（）透析法 透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。（）色谱法 随着色谱理论逐步发展，实验技术也逐步仪器化、自动化和高速化，色谱技术已经成为化学领域一个重要的分离、分析工具。 目前色谱法发

11、展的趋势是与光谱分析相结合。1.3 本文的研究对象柴胡 柴胡简介中药柴胡为伞形科植物柴胡（北柴胡, Bupleurum Chinense DC）或狭叶柴胡（南柴胡, Bupleurum. scorzonerifolium Willd）的干燥根5。前者主要产于辽宁、甘肃、河北、河南等地，后者主要产于湖北、江苏、四川等地，是常用中药之一。本经记载，“柴胡用于寒热往来，感冒发热，味辛苦，气微寒，芳香疏泄，尤善于疏散少阳半表半里，为治疗寒热往来，胸肋苦满，口苦咽干等少阳症之要药”。据文献记载6，柴胡属约100余种，我国现已经知道有36种，17变种，7变型，品种繁多，质量各异。柴胡作为药用，因为产地和使

12、用地区，不仅使用种类不同，而且使用部位也不同。有些地区使用根类柴胡，有些地区使用全草类柴胡。柴胡中柴胡皂甙a和柴胡皂甙d为有效活性成分7。本实验所用样品为北柴胡，购于武汉中联大药房鲁磨路店，其产地为河北。 柴胡皂甙的化学性质柴胡皂甙为三萜类皂甙，三萜皂甙元是由6个异戊二烯，30个碳原子构成的8。迄今为止,已证明存在的柴胡皂甙有：a、b、c、d、e、f、i、k、m、n、q、s、t，其中柴胡皂甙i、k、m、n、q、s、t为近几年新发现9-13。柴胡皂甙分子量较大，不易结晶，为无色或者乳白色无定形粉末，多数具有苦而辛辣味，其粉末对人体各部分的粘膜有强烈的刺激性，尤以鼻内粘膜最为灵敏，吸入鼻内能引起喷

13、嚏。除此外，还具有吸湿性、发泡性和较弱的溶血性。柴胡皂甙极性较大，易溶于水、热甲醇和乙醇，难溶于丙酮和乙醚。柴胡皂甙在含水丁醇中有较大的溶解度，所以常用正丁醇作为提取柴胡皂甙的溶剂。 柴胡皂甙的药学作用从柴胡的干燥根中提得柴胡总皂甙（1.6%3.8%）14，既往已经报道15.16具有镇静、止痛、解热镇咳、抗炎、保肝、抗肿瘤、降低血压、抑制由组胺和5-羟色胺引起的血管通透性增加等作用。近年来，有文献报道了一些新的进展，现汇总如下：抑制胰蛋白酶 柴胡在临床上用于治疗急性胰腺炎，但其有效成分及治疗作用机制前无报道17。抑制腺苷酸环化酶（AC） 林明栋等首次发现柴胡分离组分CH-5（柴胡粗皂甙）能显著

14、抑制小鼠肝制备AC的活性，在一定浓度范围内有明显量效关系18。柴胡皂甙衍生物具有免疫调节作用19.20。用于治疗肾小球疾病21.22。影响睡眠 现代医学研究证明，柴胡皂甙具有镇静、抗惊厥等中枢抑制作用，临床可用于多种神经系统疾病23.24。1.3.4 柴胡皂甙的研究现状迄今为止，已经证明化学结构的柴胡皂甙共有10种,分别为a、b1、b2、b3、b4、c、d、e、f、t。在以上提及的分离方法中，适合柴胡皂甙的分离的有铅盐沉淀法、色谱法，其中较常用的色谱法有吸附色谱法、分配色谱法、高效液相色谱法。有报道25用硅胶柱层析法、薄层色谱法成功分离出柴胡皂甙a、b、c，但是这些方法存在一定的缺陷，一是分离

15、时间比较长，二是分离效果不理想。1.3.5 本文所做工作本实验采用反相高效液相色谱法对北柴胡中的柴胡皂甙a进行分离与测定，检测器为紫外检测器。以乙腈和水的混合液为流动相，能达到较好的分离效果，做到快速分离，而且峰形较好。标准样品线性和重复性好，RSD（n=9）为1.09% ，检出限为2.3ng.mL-1，回收率为100.5%，结果令人满意。第二章 实验部分2.1 实验原理高效液相色谱法使混合物中各组分在两相中进行分配，其中一相是不动的固定相，另一相是液体流动相，它推动混合物流过固定相。当液相携带混合物经过固定相时，与固定相发生相互作用。由于各组分的结构性质（如溶解度、极性、蒸汽压、吸附能力）不同，这种相互作用便有强弱差异（组分不同分配系数不同）。因此在同一推动力作用下不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后顺序从装有固定相的柱中流出。分离度是指相邻两组分保留时间之差与两组分基线宽度之和的一半的比值，用Rs表示，若要达到基本分离，一般Rs = 1.0；要达到完全分离，Rs = 1.5。色谱定量分析的依据是在一定的色谱条件下