食品微生物检验方法Word文件下载.docx

1、适当十倍稀释样品选择23个连续适宜稀释度各取1mL分别加入灭菌平皿内（每个稀释度做两个平行）每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA） 35 48 2h菌落计数FDA BAM 菌落计数方法 选择25250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下： N=C/（1*n1+0.1*n2）*d 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。 所有平板的菌落数都超过100

2、/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为65*100* 1/d。 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。 最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。ISO4833-2003 菌落总数测定流程每皿内加入适量（1215mL）平板计数琼脂（PCA）， 301 ，72 3 hISO4833-2003菌落计数方法 选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下： N=C/（n1+0.1*

3、n2）*d 所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE=m 固体样品： NE=md-1 无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 菌落总数测定几点说明 由于检样中采用30/35有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位

4、（colony forming units，CFU）报告。菌落总数测定几点要求 每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。 检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。 检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼

5、脂混合的平皿，不经培养，于4 放置，以便在计数检样时用作对照。大肠菌群的定义 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠杆菌的定义 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质

6、、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+-或-+-的细菌。 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。卫生学意义 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的

7、存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。大肠杆菌的生物学特性基本形态：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37，在42-44 条件下仍能生长，生长温度

8、范围15-46 。大肠菌群及大肠杆菌测定 MPN法检验流程（FDA BAM）检样50g+450ml稀释液选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL 35 ，24 2h 48 没有产气管 有产气管 报告阴性 接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤 44.50.5 （水浴培养） 24 查MPN表报告结果 产气管接种EMB平板（35、1824h） （大肠菌群） 从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜 面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接 种LST复检产气 查MPN表报告结果（大肠杆菌） 大肠菌群测定MPN法检验几点说明 MP

9、N检索表： MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 初发酵和证实试验： 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。 产气量与倒管： 在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡

10、。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽 EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长； 高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀； 大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽； 该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌

11、时都应在避光条件。大肠杆菌测定革兰氏染色基本步骤： 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗； 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗； 滴加95%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗； 滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。大肠杆菌测定生化鉴定（表略）金黄色葡萄球菌概述 根据伯杰氏鉴定细菌学手册，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和腐生葡萄球菌（S. saprophyticus），其中金葡多为致

12、病性菌，表葡偶尔致病。 金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。金黄色葡萄球菌生物学特性金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8m左右，排列成葡萄串状 ，无芽孢，无荚膜。金黄色葡萄球菌生长特性 金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。金黄色葡萄球菌检验方法适用性 MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金

13、黄色葡萄球菌的食品。 直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品。 增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。金黄色葡萄球菌检验直接平板计数法（FDA BAM &ISO）检样（50g+450mL稀释液） 适当十倍稀释样品吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验） 35 ，4548 h确证试验报告FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验MPN法每个稀释度接种三管10% NaCl TSB肉汤， 35 ，48 2 h从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上 35 ，48 hFDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验1.凝固酶试验 方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合