实验一还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法Word文档下载推荐.docx

1、实验二 油脂酸价的测定 5实验三蛋白质的提取及浓度测定 ？（紫外吸收法） 7实验四 淀粉酶活力的测定 9实验五 酶的激活和抑制作用 13实验六 氨基酸的分离鉴定一一纸层析法 14实验七 基因组DNA的快速提取-碘化钾法 16实验八琼脂糖凝胶电泳技术一一DNA样品检测 18实验一 还原糖和总糖的测定一一 3,5-二硝基水杨酸比色法、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是 还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

2、利 用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和 多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含 量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物， 3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分 光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖 的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应 乘以0.9。小麦面粉（1000 g）2主要

3、仪器3.试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液100 mg,置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至 100 mL,混匀，4C冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中， 溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL ,再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL（3）碘-碘化钾溶液：称取 5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取 0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。（5）6 M HCI

4、 和 6 M NaOH 各 100 mL。（分别取 59.19 mL 37% 浓盐酸和 24 克 NaOH 定容 至 100mL）四、操作步骤1.制作葡萄糖标准曲线取7支20 mL具塞刻度试管编号， 按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、 蒸馏水 和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1葡萄糖标准曲线制作管号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水DNS （mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540nm）21.510.21.80.41.630.61.440.81.251.06将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5 min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至

5、20 mL，加塞 后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540 nm,用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（ mg ）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。葡萄糖标准曲线葡萄糖含量（mg2.样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取蒸馏水，搅匀，置于 50C恒温水浴中保温 20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取（以葡萄糖计）。计算出7、8号管光密度值的平均值和 9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和

6、总糖的百分含量还原糖（% =查曲线所得葡萄糖毫克数x测定液总体积积xx 0.9 x 100样品毫克数 1003总糖（% =查曲线所得水解后葡萄糖毫克数X稀释倍数样品毫克数、, 、卜 、八六、 注意1.标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。2.面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、 思考题1在样品的总糖提取时，为什么要用浓 HCI处理？而在其测定前，叉为何要用 NaOH中和?2标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？比色时设 0号管有什么意义？3.绘制标准曲线的目的是什么？实验二油脂酸价的测定一、目的与要求初步掌握测定油脂酸价的原

7、理和方法；了解测定油脂酸价的意义。油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。 酸价越高，油脂的质量也越差。三、 主要仪器、实验材料和试剂1.锥形瓶（250 mL）3个。2.量筒（50 mL）1 支。3.碱式滴定管1支。4.花生油、菜油、芝麻油等。5.乙醇-乙醚混合液（1:1,V/V）。6.0.1 % KOH （1 克 KOH 溶于 1000 mL 纯

8、水中）。四、 操作步骤1.准确称取12 g油脂于250 mL锥形瓶中。2.在瓶内加入乙醇乙醚混合液 50 mL,充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。待油样完全溶解后，加入 1 %酚酞指示剂35滴，立即用0.1% KOH标准溶液滴定至溶液成微红色（放置30 S内不褪色）为终点，并记录用去的 KOH的体积，并按下式进行计算。酸价=2（V2-V1）/WV2 :滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数V1 :滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数W:油样重（g）注：滴定过程中如出现混浊或分层， 表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加乙醇，促使均一相体系的形成。五、实验

9、结果油脂名称起始刻度终点刻度 、体积 （mL）酸价备注空白对照六、思考题测定油脂酸价时，装油的锥形瓶和油样中均不得混有无机酸，这是为什么?实验三 蛋白质的提取及浓度测定（紫外吸收法）一、 目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光 度计的使用方法。二、 实验原理大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密

10、度 OD280nm与其浓度呈正比关系， 可作定量测定。三、 实验材料、主要仪器和试剂1试验材料：萌发3天的小麦种子2.主要仪器（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管 （5）研钵 （6）100 mL容量瓶3试剂：标准牛血清蛋白溶液： 准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白， 配制成浓度为1mg/ mL （0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至 500 mL ）的溶液。1 蛋白质（淀粉酶）的提取称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约 1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和 2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用 6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下 /

11、放置提取1520 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000 r/min转速下离心10min , 将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓 度的测定。2.标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为 1cm的石英比色杯，在 280 nm波长处测定各管溶液的光密度值 OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。表1蛋白质标准曲线制作标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm0.53.50.1253.00.252.50.3752.00.500.62570.7584.0