RNA干扰技术基本原理与应用PPT推荐.ppt

1、1289-1292RNAi的主要特点和优势的主要特点和优势l诱导转录后水平的基因沉默诱导转录后水平的基因沉默l具有高度的特异性具有高度的特异性l抑制基因表达的效率非常高抑制基因表达的效率非常高l可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化基因沉默系统化”siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶l共同点共同点F 特异性特异性F 靶向性靶向性siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶l不同点不同点F独特的双链结构独特的双链结构F需要需要Dicer、RdRp、解旋酶、激酶等协同因子、解旋酶、激

2、酶等协同因子FsiRNA 本身无催化活性本身无催化活性F在细胞内可能具有相对的稳定性在细胞内可能具有相对的稳定性F具有一定的可遗传性具有一定的可遗传性RNAi的主要过程的主要过程l启动阶段启动阶段 dsRNA（500nt左右最佳左右最佳）被被Dicer 酶酶特异性识特异性识别，以一种别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成依赖的方式逐步切割成siRNA 长度：长度：21-25nt 结构：结构：3端悬垂两个未配对的碱基端悬垂两个未配对的碱基UU细胞中内源性细胞中内源性dsRNA的形成的形成l基因组中基因组中DNA 反向重复序列的转录产物反向重复序列的转录产物l同时转录反义和正义同时转录反义和正义RN

3、A l病毒病毒RNA 复制中间体复制中间体l以单链以单链RNA 为模板由细胞或病毒的为模板由细胞或病毒的RNA 依赖依赖RNA 聚合酶聚合酶（RdRp）催化合成催化合成dsRNADicer酶酶lRNAase III超家族成员。超家族成员。结构中包括一个螺旋结构中包括一个螺旋酶结构域，两个酶结构域，两个RNA酶酶结构域，一个双链结构域，一个双链RNA结合位点结合位点l对单链对单链RNA没有活性没有活性l对对200500nt的的dsRNA作用效果最好，能降作用效果最好，能降解成解成25nt左右的左右的siRNAl广泛存在广泛存在RdRp（RNA dependent RNA polymerase）l

4、使异常的使异常的RNARNA转变为转变为dsRNAdsRNAl参与细胞内参与细胞内dsRNA和和siRNA的扩增的扩增lsiRNA与靶与靶mRNA 的结合可激活的结合可激活RdRp，形成，形成大量的大量的dsRNARNAi的主要过程的主要过程l效应阶段效应阶段FRNA诱导沉默复合体（诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）的形成的形成 siRNA、核酸内切酶、外切酶和解旋酶、核酸内切酶、外切酶和解旋酶FRISC的激活：的激活：ATP依赖的解双链过程依赖的解双链过程F在在siRNA反义链的指导下，反义链的指导下，RISC特异性切特异性切 割、降割、降

5、解靶解靶mRNA，导致基因表达失活，导致基因表达失活 RNAi技术的实验方法技术的实验方法lsiRNA的设计原则的设计原则F序列大小序列大小 19-21nt，最好以，最好以A或或G开始开始F从从mRNA的的AUG开始，寻找开始，寻找AA二连序列，二连序列，作为潜在的作为潜在的RNAi靶位点靶位点F不要针对不要针对5和和3端非编码区（端非编码区（untranslated regions，UTRs）RNAi技术的实验方法技术的实验方法lsiRNA的设计原则的设计原则F设计设计24个序列个序列,BLAST 比对基因序列以确保比对基因序列以确保序列设计的特异性序列设计的特异性F优先选择优先选择 GC

6、含量含量30-50%的序列的序列F设计适当的阴性对照序列设计适当的阴性对照序列阴性对照序列的设计阴性对照序列的设计l特异性特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCGl在特异性在特异性siRNA引入引入12个错配碱基个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG目标序列筛选的相关网站目标序列筛选的相关网站http:/www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp:/sfold.

7、wadsworth.org/sirna.plhttp:/ 查找已经证实的查找已经证实的siRNA的网站的网站lhttp:/ siRNA的制备方法的制备方法l体外制备方法体外制备方法F化学合成化学合成siRNAF体外转录获取体外转录获取siRNAF利用利用Dicer或或 RNase消化长的消化长的dsRNA成成siRNA化学合成法制备化学合成法制备siRNAl优点：优点：纯度高纯度高 合成量不受限合成量不受限 能被标记能被标记l缺点：缺点：价格昂贵、合成周期长价格昂贵、合成周期长l用途：用途：已经找到最有效的已经找到最有效的siRNA的情况下，的情况下，需要大量需要大量siRNA进行研究进行研究

8、 体外转录法制备体外转录法制备siRNAl优点：简单简单 成本低成本低 速度快速度快 毒性小毒性小 稳定性好稳定性好 l缺点：反应规模和量始终有一定的限制反应规模和量始终有一定的限制l用途：筛选筛选siRNAs，特别是需要制备多种，特别是需要制备多种 siRNAs 消化法（消化法（“siRNAs 鸡尾酒鸡尾酒”）l优点：无需检测或筛选多个无需检测或筛选多个siRNA序列序列 产生多种产生多种 siRNAs 混合体，保证有效的混合体，保证有效的 目的基因沉默目的基因沉默l缺点：有可能引发非特异的基因沉默有可能引发非特异的基因沉默 l用途：快速而经济地研究某个基因功能缺失快速而经济地研究某个基因功

9、能缺失 的表型的表型 siRNA的制备方法的制备方法l细胞内制备方法细胞内制备方法F依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNAF通过通过PCR介导的介导的siRNA表达试剂盒获取表达试剂盒获取siRNAsiRNA载体载体l依赖依赖RNA聚聚合合酶酶III 启动子启动子（pol III），操纵操纵一一段段小的小的发夹发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。在哺乳动物细胞中的表达。人源人源U6启启动子动子 鼠鼠源的源的U6启启动子动子 人人H1启启动子动子lpol III可可在细胞中表达许多的小分子在细胞中表达许多的小分子R RNA，通过通过添加添加一一串串（36

10、个）个）U来来终终止转录的止转录的l需要订购需要订购2段编码短发夹段编码短发夹RNA序列的序列的DNA单链单链再克隆到载体中再克隆到载体中 表达载体法制备表达载体法制备siRNAl优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中可以进行较长期研究。载体可以在细胞中 持续抑制靶基因达数星期或更久持续抑制靶基因达数星期或更久l缺点：需要进行克隆，周期长需要进行克隆，周期长 质粒载体表达效率较低质粒载体表达效率较低l用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法基于基于PCR的的siRNA表达框架表达框架（SECs）l组成：组成：RNA pol III启动子启动子 发夹结构发夹

11、结构siRNA RNA pol III终止位点终止位点l制备：制备：PCR，无需克隆和测序，无需克隆和测序用用SECs制备制备siRNAl优点优点：F可直接由可直接由PCR得到，方法简便，时间短得到，方法简便，时间短F在在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出片段两端添加酶切位点，筛选出 最有效最有效的的siRNA可用于构建表达载体可用于构建表达载体F可以用来筛选特定研究体系中启动子和可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的的最适搭配最适搭配 用表达框架制备用表达框架制备siRNAl缺点缺点：FPCR产物很难转染到细胞中产物很难转染到细胞中F不能进行序列测定，不能进行序列测定，PCR和和DN

12、A合成时可能合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想产生的误读不能被发现导致结果不理想 l用途用途：F筛选筛选siRNA序列序列F在将在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子克隆到载体前筛选最佳启动子 shRNA（short hairpin RNA）文库文库l Nature 2004；428：427-431（25 March）针对：针对：9,610 human genes 5,563 mouse genes 构建成：构建成：28,000个个shRNA表达盒表达盒（cassettes）l商品化试剂盒：商品化试剂盒：Expression Arrest（美国冷泉港实验室美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司公司）网上数据库中选择特定的网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时克隆，无需再耗时耗力进行耗力进行siRNA的设计、