Survivin反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡及逆转多西他赛耐药机制的实验研究Word下载.docx

1、多西他赛；多药耐药基因Experimental study on apoptosis of ovarian cancer cells and reversal docetaxel drug resistance induced by Survivin antisense RNA【Abstract】 AIM: To establish Survivin antisense RNA and explore its effect on the apoptosis of ovarian cancer cells and the sensitivity to docetaxel and its mech

2、anism of reversing docetaxel drug resistance. METHODS: Survivin antisense eukaryotic vector （antipcDNA3svv） was transferred into Skov3 cells by electroporation and positive clone was screened out. Survivin protein was detected by Western blot; effect of apoptosis inducement was observed by flow cyto

3、metry; sensitivity to docetaxel was examined by MTT; expression of MDR1 mRNA was detected. RESULTS: Survivin protein of positively cloned cells were reduced obviously as compared with that of nontransfered cells. Terminal apoptotic change was observed by flow cytometry and the apoptosis rate was 19%

4、; IC50 of experimental group to docetaxel was （） ng/mL and control group was ng/mL, so the statistical difference was significant （P<. Expression of MDR1 mRNA of Skov3SVVanti group was reduced obviously as compared with that of Skov3 group （P&. CONCLUSION: Survivin antisense RNA can induce ovaria

5、n cancer cell apoptosis and increase the sensitivity to docetaxel by reducing the expression of MDR1 mRNA.【Keywords】 survivin antisense RNA; ovarian neoplasms; apoptosis; docetaxel; MDR1【摘要】 目的: 构建Survivin反义真核表达载体（antipcDNA3svv），探讨其对卵巢癌的凋亡诱导作用、对多西他赛的化疗增敏作用及逆转耐药的机制. 方式：采纳Survivin反义核酸瞬时电转染法转染卵巢癌细胞系Sko

6、v3, 挑选出阳性细胞株. 以Western blot检测Survivin蛋白的表达，用流式细胞仪检测其对Skov3的凋亡诱导作用，采纳MTT法检测其对多西他赛的化疗增敏作用，并检测实验组细胞（Skov3SVVanti）MDR1 mRNA的表达. 结果：稳固表达antipcDNA3svv的Skov3SVVanti其Survivin蛋白表达比未转染者明显降低，Skov3SVVanti组细胞流式细胞仪检测显示其凋亡率为19%，对多西他赛的IC50值为（）ng/mL,而对照组（Skov3）为 ng/mL，不同具有明显的统计学意义（P&. Skov3SVVanti组MDR1 mRNA表达较Skov3组

7、明显减少（P&）. 结论：Survivin反义核酸可诱导卵巢癌细胞凋亡，并通过降低MDR1 mRNA表达增强多西他赛化疗灵敏性.【关键词】 Survivin反义核酸；0引言上皮性卵巢癌是常见的妇科肿瘤，具有易转移及复发的特性，因此手术后化疗是卵巢癌标准化医治最重要的内容之一. 多西他赛（docetaxel）又名泰索帝是医治卵巢癌的新药，其联合铂类医治卵巢癌临床减缓率远高于铂类联合其他化疗药. 可是关于一些复发和多处转移的患者，多西他赛也产生了耐药现象. Survivin是新近发觉的IAP（inhibitor of apoptosis protein）家族成员，能抑制caspase 活性而发挥抗

8、凋亡作用. 已有研究证明1，Survivin基因的高表达与化疗耐药有紧密关系，抑制Survivin基因的表达能增加肿瘤组织对化疗的灵敏性，关于维持正常细胞生物学特性具有重要作用2. 本研究旨在研究应用反义策略阻断Survivin表达，对诱导卵巢癌细胞凋亡及提高卵巢癌细胞多西他赛灵敏性的作用，并进一步探讨其逆转耐药的机制.1材料和方式细胞株和细胞培育人卵巢癌细胞株Skov3由哈尔滨医科大学肿瘤研究所惠赠. 用含有100 mL/L胎牛血清（Gibco公司）的RPMI 1640（Gibco公司）培育（37，50 mL/L CO2）. 顺铂（ & Co Ltd公司）及多西他赛（Aventis

9、Pharma, Dagenham公司）溶解于DMSO（Gibco公司），4保留.反义真核表达载体（antipcDNA3svv）的构建Survivin基因通过RTPCR方式克隆取得. 应用Trizol（Takara公司）法从卵巢癌细胞株Skov3中抽提总RNA，正向引物为5atattctagaccatgggtgccccgacgttgc3,反向引物5aatcgaattctcaat ccatggcagccagctg3. PCR扩增条件为：94预变性2 min,94 1 min，60 1 min，72 1 min，共30循环,72延伸10 min，扩增产物用琼脂糖回收试剂盒回收提纯后，扩增产物进行结尾

10、连接腺嘌呤（A）反映，与带有胸腺嘧啶结尾（T）的载体（Invitrogen公司,CTGFPTOPO）连接. 重组体转化感受态大肠杆菌DH5,挑选Amp阳性克隆者小量抽提质粒（质粒抽提试剂盒Takara公司），送去测序（上海生工公司）. 经测序，选出其中反向连接者，命名为antipcDNA3svv.电转染Skov3细胞及阳性克隆的挑选搜集6106细胞于预冷的 cm电转杯中，加入antipcDNA3svv 15 L，终体积800 L， 300 V电压电穿孔 ms，48 h后传代培育，加入含有G418的培育基挑选阳性克隆，浓度由200 mg/L渐加至800 mg/L，共挑选42 d，可见有抗性细胞生

11、长，命名为Skov3SVVanti. 上述一样条件空质粒转染Skov3,挑选出阳性克隆命名为Skov3neo. 分为3组：Skov3SVVanti组（实验组）、Skov3neo组（空质粒组）及Skov3组（空白对照组）.转染细胞Survivin蛋白表达的检测将3组细胞培育48 h，PBS漂洗3次后加入4的50 L裂解液，冰浴20 min，12 000 g/min离心后取上清液. Bradford法测定蛋白浓度. 取每种样品各40 g，100 g/L SDS PAGE凝胶电泳分离，通过点转移法将蛋白质从SDS PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜后在含有50 g/L脱脂奶粉的TTBS中37封锁90 m

12、in，加入11000羊抗人Survivin（上海中山公司），4留宿，TTBS充分漂洗后加入14000兔抗羊lgG/HRP（上海中山公司）,室温孵育1 h，TTBS充分漂洗，洗膜后加入LumiGLO化学发光试剂作用1 min. X线暗室曝光，常规显影定影. 一样实验条件重复4次. 图像以Bio Rad图像分析系统分析，用蛋白条带的平均光强度值表示Survivin表达的相对强度.流式细胞仪观看肿瘤细胞凋亡细胞传代培育48 h后，搜集10106个细胞，分成10个样本，每一个样本1106个细胞. 用700 mL/L的乙醇0固定，留宿，PBS洗涤并重悬细胞，加入PI染液1 mL（EB 10 g,PI 5

13、0 g, RNase酶10 g, 枸橼酸钠5 mg, TritonX100为 L，加生理盐水至1 mL）,室温下孵育30 min,流式细胞仪检测. 观看亚二倍体峰的转变. 凋亡率采纳上述样本的均值. 结果以lysis软件分析.细胞对多西他赛灵敏性分析（MTT）备96孔板，每孔加入100 L的1105的Skov3，Skov3neo，Skov3SVVanti细胞，每种细胞加7孔，其中1孔做调零用，每孔依次加入0，1，10，20，50，100 （g/L）多西他赛， 37培育48 h后，每孔加入MTT（10 g/L） 10 L,培育4 h，弃上清液，每孔加入150 L二甲基亚枫（DMSO），振荡10

14、min，酶标仪测定490 nm处吸光度（A）值. 依照A值计算细胞存活率并计算细胞生长抑制50%的多西他赛浓度，即IC50值. 记录加多西他赛50 g/L后0，24，48，72 h细胞生长曲线. 上述实验重复三次，取均值. 三组间IC50比较采纳采纳方差分析进行.反义Survivin核酸对MDR1 mRNA表达的阻碍上述3组细胞利用Trizol（Takara公司）法提取总RNA，RTPCR法扩增MDR1 mRNA，进行比较. MDR1的上、下游引物别离为为：5CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3；5CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3，扩增片段412 bp. 以actin为内参

15、照（上、下游引物别离为：5CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3,扩增片段127 bp）. 扩增产物用20 g/L琼脂糖电泳，依照条带亮度的不同进行分析. MDR指数：MDR值/actin值. 三组间MDR指数比较采纳方差分析.2结果重组质粒的构建和鉴定利用RTPCR方式从Skov3细胞克隆出Survivin基因，全长451 bp，经电泳证明扩增片段与预先设计片段大小一致. 与载体以AT策略连接后转化感受态大肠杆菌，挑取阳性克隆酶切鉴定，再经上海生工公司测序与基因库中序列完全符合（图1），选取其中与反向连接者命名为antipcDNA3svv. 由此取得真核表达载体.转染后稳固表达反义Survivin细胞克隆的获取阴性转染细胞在G418 800 mg/L浓度时死亡，阳性转染细胞渐形成单细胞克隆Skov3SVVanti（图2）. 采纳胰酶定点消化的方式，将单细胞克隆洗脱到25 mL细胞培育瓶，进行传代培育，培育成含有antipcDNA3svv的细胞株.转染antipcDNA3svv对Skov3中Survivin蛋白表达的阻碍Western bl