1、另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n。到目前为止,RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体,较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点,但只能感染分裂期细胞,载体容量8kb,与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险,故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞,具有广泛的宿主范围和更高的转染效率,可高效的转染静止细胞,并能抵抗
2、血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景 。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性,降低其潜在的危险性,可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽,目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV);还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒,提高了RV载体的安全性。2 腺病毒(adenovirus,AV)载体腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来,迄今为止大约有40基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体,仅次于RV载体_3 J。至
3、今AV载体已经发展了4代,第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列,与第一代相比,有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列(1TRs)和包装信号,载体容量达37kb,进一步降低了免疫原性,被称为“高容量”载体。AV载体具有宿主范围广、基因转移效率高、对非分裂细胞也有感染性、比较容易制备和操作、理化性质稳定、遗传毒性较低及比较安全等优点。目前研究最多的是Ad2和Ad5 。正是由于AV载体宿主范围广,使其缺乏靶向性。又AV载体不能整合到靶细胞的基因组DNA中,且可诱发机体的免疫反应,故其介导的转基因表达时间短,并限制其反复应用。AV载体的安全性和靶向性已成为研究的热
4、点。靶向性包括靶向转导和靶向转录。靶向转导的一个理想策略是对腺病毒外壳进行改造,一方面消除腺病毒载体与柯萨奇,腺病毒受体(CAR )结合进入细胞的途径。另一方面使改造后的腺病毒能选择性地与靶细胞膜表面的特异性受体结合。HI-loop暴露于Ad纤维蛋白的球部,允许被插入100个氨基酸,如在此插入精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)序列等多肽可实现靶向转导 。Ad5还可通过嵌合其他血清型,改变纤维蛋白而实现靶向转导,如Ad53载体(其纤维蛋白由Ad5的尾部和轴心与Ad3的球部组成) J、Ad535载体(由Ad35的纤维蛋白插入Ad5的衣壳蛋白而形成) J。此外,可通过双功能分子和双特异性抗体介导靶向
5、转导。转录水平的靶向性调节主要利用组织或肿瘤特异性启动子控制目的基因的表达。人们正在寻找在所有肿瘤细胞中均有活性的通用启动子。E2F-1是一种重要的转录因子,它常常在肿瘤细胞中高水平表达。有研究利用E2F-1启动子控制E1A基因,构建了可以裂解肿瘤细胞而不影响处于静止期的正常细胞的Av载体AdE21RC,在小鼠卵巢癌和肺癌移植模型中,AdE2F-1RC治疗效果好于野生型腺病毒。Huang等_8 通过端粒酶逆转录酶(3TRT)基因启动子控制E1A基因表达,构建了AdvTERTp-E1A,可明显抑制肝癌细胞的生长。此外,甲胎蛋白(AFP)启动子装入AV载体,能有效控制胸苷激酶(tk)基因在AFP阳
6、性肝癌细胞中的表达。为了降低Av载体的免疫原性,目前的主要途径是用聚乙二醇(PEG)修饰腺病毒表面或发展不含或只含很少病毒基因的新型AV载体,如无肠型腺病毒或微小腺病毒。条件复制型腺病毒(GRAd)只在肿瘤细胞内复制,而在正常细胞中不复制,具有产生溶瘤效应、旁观者效应及明显提高治疗基因的表达效率等优势。主要有两种类型:肿瘤增殖腺病毒(ONXY-I5)可在r63突变了的肿瘤细胞内复制。Ad5一,24可在Rb基因突变了的肿瘤细胞内复制。故条件复制型腺病毒具有相对的靶向性,作为载体的同时,还有肿瘤治疗作用I 。此外,动物腺病毒载体比人腺病毒载体具有更好的安全性和有效性,可以反复应用,利用它作为基因治
7、疗的载体具有很好的前景。3 腺相关病毒(adeno-associated virus,AVV)载体腺病毒相关病毒(AAv)是一种缺陷型的单链DNA病毒,只有在辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等存在的情况下,才能进行最佳复制,产生新的病毒颗粒,否则只能进行潜伏感染。从v载体既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞,在宿主体内以定向整合的方式存在,70 以上的整合位点位于第19号染色体q133-qter区,且对人体无致病性,故AAv重组体在细胞内能长期稳定地表达,还可避免随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险,且在体内不引起明显的病理变化,表明AAV是一种很有前途的基因治疗载体_
8、9j。AAv载体在多种组织已进行了成功的转染,如肝、脑、心肌、骨骼肌、视网膜和呼吸道上皮等组织,未发现对机体有致病性 。AAv载体能转染非分裂期细胞和持久表达转基因产物的特点,适用于人造血干细胞基因转染。目前研究最多的是AAV-2。从v作为基因治疗的载体,其包装容量3周,说明HSV载体适用于干细胞的基因转移 。6 展望近年来,基因治疗病毒载体的研究取得了较大进展,数个病毒载体已实现体内转基因的长时间表达,但病毒载体的安全性问题还有待进一步的研究解决,安全性和靶向性一直是人们研究的热点。研究表明通过使用组织特异性启动子或多聚物和脂质体的修饰,可提高基因转移的靶向性,且多聚物和脂质体的修饰还可减轻免疫反应,有利于载体的重复应用。载体中不必要的病毒基因的去除可明显减轻细胞毒性和免疫原性,还可避免产生可复制的病毒颗粒和人体感染病毒的危险。自我灭活或自我破坏病毒载体的构建也能提高病毒载体的安全性。此外,外源基因的定位整合可避免随机整合致突变事故的发生。总之,随着基础医学和分子病毒学的发展,人们对病毒载体的进一步改造完善,将使其在基因治疗中继续发挥着重要的作用。
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