高效液相色谱常见故障.doc

1、高效液相色谱仪常见故障的断定及解决(一)高效液相色谱仪保留时间变化 1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱 2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够用25mmol/L的缓冲液 4.柱污染每天冲洗柱 5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命采用保护柱 (二)高效液相色谱仪保留时间缩短 1.流速增加检查泵,重新设定流速 2.样品超载降低样品量 3.键合相流失流动相PH值保持在37.5检查柱的方向 4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加柱恒温 (三)高效液相色谱仪保留时间延长 1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2

2、.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失同前(二)3 4.流动相组成变化同前(二)4 5.温度降低同前(二)5 (四)高效液相色谱仪出现肩峰或分叉 1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏更换进样器转子 (五)高效液相色谱仪鬼峰 1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物处理样品 3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子

3、对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量， 用HPLC级的水 (六)高效液相色谱仪基线噪声 1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.检测器灯连续噪声更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压 (七)高效液相色谱仪峰拖尾 1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品 4.同

4、前(四)4同前(四)4 5.同前(四)35.同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)高效液相色谱仪峰展宽 1.进样体积过大同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点 4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度

5、降至最小 9.样品过载进小浓度小体积样品既使日常精心维护的液相色谱仪，随着使用时间的增加或使用者经验不足也会出现一些问题或故障。1.保留时间变化保留时间的变化有三中情况：波动、缩短、延长。保留时间出现波动时，应检查柱温是否处于恒温状态，如果设置为室温，气温的变化会引起保留时间的波动，应该设置为恒定温度;等度和梯度间还没有充分达到平衡状态时，应该用十倍以上柱体积的流动相去平衡色谱柱;缓冲液浓度太低时，应换用25mmol/L的缓冲液;色谱柱被污染或已经接近柱寿命时，应更换保护柱或换新色谱柱。保留时间缩短时，流速增加，应检查流速的设定;柱温高时，应检查柱的设置;进样量太大时，减少样品用量或降低样品浓

6、度;流动相的组成发生了改变，比如流动相中易挥发有机相蒸发，两相之间互溶不好，会导致流动相不均匀或某一相出现部分沉淀;流动相的PH值应保持37.5范围内，否则会引起柱键合相的流失。保留时间延长时，流速减小，应检查流速的设定和管路是否有泄露;柱温低时，检查柱温的设置;流动相的组成发生了改变，比如流动相中易挥发有机相蒸发，两相之间互溶不好，会导致流动相不均匀或某一相出现部分沉淀;检查流动相的pH值是否37.5范围内，否则会引起柱键合相的流失。2.峰拖尾色谱柱超载时，要减少进样量或稀释样品或使用高溶量的色谱柱;色谱柱性能不佳时，更换色谱柱;死体积或柱外体积过大时，将连接降至最低，并对所有连接点作合理的

7、调整，尽可能采用细内径的连接;加入硅羟基，其作用是纯化色谱柱，增加缓冲液的浓度，降低流动相的pH值，纯化样品;出现峰干扰时，应清洁样品，调整流动相。3.峰展宽进样体积过大时，用流动相配样;样品过载时，进小浓度、小体积样品;在进样阀中造成峰扩展时，进样前后排出气泡，以降低扩散;流动相粘度过高时，提高柱温，并采用低粘度流动相;等度洗脱，保留时间过长时，要增加流速或改用梯度洗脱;柱外体积过大时，1将连接管径和连结管降至最小。4.基线噪声流动相或检测器中有气泡时，要对流动相进行脱气处理;检测器灯有连续噪声时，更换氘灯;出现由污染引起的随机噪声时，应清洗色谱柱、净化样品、使用HIPLC级试剂;偶然有噪声

8、时，可能是来自电源的干扰，如果电压不稳时，应采用稳压电源。5.肩峰或分叉进样量太大或样品浓度过高时，要减少进样量或稀释样品;样品溶剂太强时，应使用软弱的样品溶剂;色谱柱性能欠佳时，应更换色谱柱。6鬼峰色谱柱未达到平衡时，要继续平衡色谱柱;样品中溶剂出峰时，使用流动相作样品的溶剂;出现进样阀残余峰时，使用强溶剂清洗进样阀，并改进阀和样品的清洗程序;流动相用水不合格率，应使用HPLC级的水。使用注意事项在使用混合溶剂作流动相时，一定要先混合，再过0.45um滤膜;等流动相恢复至室温，用超声波或He气进行脱气处理后，方可使用。更换流动相时，必须按一定的程序进行，否则会产生问题。更换流动相有三种情况：

9、互溶性流动相的更换、无互溶性流动相的更换和缓冲溶液的更换。对于第一种情况，先用准备更换的流动相把吸滤器完全清洗干净，再打开仪器的排液阀，按清洗键，清洗泵中的流动相。将吸滤器放入新流动相中，减慢流速清洗数分钟后关闭排液阀。接下来清洗色谱柱和检测器检测池直到基线平稳。对于第二种情况，先用与新旧流动相都互溶的中间清洗液(如：异丙醇)清洗，再用新流动相清洗，具体过程与第一种情况相同。对于第三情况，应先用蒸馏水作为中间清洗液进行清洗，再用新流动相清洗即可。问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？ 答:关于漂移问题： 1.温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保

10、持柱温恒定 2.流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 3.柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡 关于快速变化问题 1.流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 2.泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。 3.流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合 问:色质联用中毛细柱的选择应注意什么问题？ 答:1.柱效要高 2.热稳定性好 3.化学惰性强 具体选择应注意 1.柱极性。根据分析样品选择不同极性的柱子进行分析 2.柱子内径。内径大小决定柱容量 3.液膜厚度。分析样品温度不一样，对膜厚有不同要求，温度高液膜要厚，温度低液膜要薄 4.柱长度。

11、柱越长，柱效越高，分离效果越好，但也存在吸附问题，柱子过长，分析时间长，因此要根据样品考虑柱子长度 5.外涂层(柱体)的选择。 6.另外还有仪器型号、分析对象等因素 问:液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？ 答:1.筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。 2.存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子 问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏？ 答：1.分配容量(或容量因子)K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好 2.理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定

12、 3.柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。 4.噪声。热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加。 5.柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。 问：为什么进样器内的玻璃衬套会对色谱行为造成影响？ 答：进样器内的玻璃衬套主要有下列作用： 1.提供一个温度均匀的汽化室，防止局部过热。 2.玻璃的惰性不不锈钢好，减少了在汽化期间样品分解的可能性。 3.易于拆换清洗，以保持清洁的汽化室表面，一些痕量非挥发性组分会逐渐积累残存于汽化室，高温下会慢慢分解，使基流增加，噪声增大，通过清洗玻璃衬套可以消除这种影响。 4.可根据需要选择管壁厚度及内径适宜的玻璃衬套，以改变汽化室的体积，而不用更换整个进样加热块。 从以上几个方面可以知道玻璃衬套对色谱行为造成影响的原因。 问：毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么？ 答:1.进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。 2.进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。 3.在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。 4.系统的进样垫、柱接头等地方漏气。