1、近年国内Tet抗肝纤维化研究也由此逐渐走向低谷。为减少毒副反应,拓展该药物的临床应用,我们近四年从降低Tet的单药剂量、联合用药及改造药物毒性基团等方面进行实验性探索。新近,我们在国内外首次发现,低浓度Tet能上调转化生长因子(transforming growth factor factor ,TGF-)抑制性信号分子Smad 7表达,调控TGF-Smad信号通路,抑制体外培养静止期HSC活化,阻断TGF-1促静止期HSC活化效应,Tet还诱导活化HSC活化逆转。部分最新研究成果已经整理成文发表在本领域有一定影响力的SCI索引源期刊上,并被SCI收录(收录号 IDS Number: 963X
2、N )2(相关文章参详见申请人简历及附件二、三)。这些全新研究成果进一步增强了我们开发这一传统中药的信心。TGF-1是目前认识的最重要的促肝纤维化因子。抑制TGF-1对HSC的作用一直以来均是抗肝纤维化重要着眼点3。Smad 7是HSC TGF-信号通路的最主要负反馈调节信号分子,上调Smad 7是抑制TGF-对HSC不良生物效应的有措施之一4。在肝纤维化过程中,TGF-信号通路还与整合素信号通路存在密切联系。这表现在三个方面:XXXXXX。XXXXXX。XXXXXXXXX。综上所述,XXXXXXX,如能XXXXXX,可进一步实现XXXXX治疗。基于以上研究结果,我们研究室在国家自然科学基金资
3、助下,过去三年中应用化学方法合成了RGD和M6P,并将RGD与M6P结合成一新型复合分子RGD-M6P,研究比较了它们对HSC靶向性及在抑制其功能中的作用(项目名称:RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究,编号:30170412)。我们的研究发现,RGD和RGD-M6P均可抑制HSC活化。RGD在抑制TGF-激活同时,还可阻止HSC与ECM结合,阻断整合素信号转导。研究还发现,M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性,增加其局部浓度,使RGD-M6P显示出较RGD更强的抑制作用14。我们首次证实,新型复合分子RGD-M6P用于抗肝纤维化治疗,无论在对HSC靶向的特异性,还是多位点联合
4、作用方面,都优于单一的含RGD序列的肽段或M6P(参见基金结题摘要,相关文章参见申请人简历及附件四)。RGD-M6P新型复合分子的研制成功及其对HSC靶向与抑制功能的发现,有助于我们去研究更多的HSC靶向选择性高、局部作用强、系统毒性小的新型药物和(或)制剂,从而提高药物的疗效、减轻毒性反应。结合我们对Tet药理作用的分子机制的研究结果,不难发现,XXXXXXXX。基于以上系列研究基础与设想,紧跟国内外在制剂学方面的进展,我们拟设计XXXXXXXXXXX。当前,受体调节药物靶向(receptor-mediated drug targeting)作为一种新型的给药系统受到人们的重视16。XXXX
5、XXXXXXXXXXXXX。迄今为止,尚未见到XXXXXXXXXXX。结合国内外同行的研究报道与我们的研究基础,不难推断,XXXXXXXXXXXXXXXXX。综上所述,我们拟在XXXXXXXXXX。本研究将为XXXXXXXX等提供理论与实践基础。XXXXXXXXXX可以设想,如能取得预期效果,经过良好设计的基础研究后,这一XXXXXX应用于临床的时间不会太久,前景广阔。参考文献1 Friedman SL. Mechanisms of disease: Mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. Nat Clin Pr
6、act Gastroenterol Hepatol 2004;1(2):98-105.2 Chen YW, Li DG, Wu JX, et al. Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7. J Ethnopharmacol 2005;100(3):299-305.3 Breitkopf K, Haas S, Wiercinska E, et al
7、. Anti-TGF-beta strategies for the treatment of chronic liver disease. Alcohol Clin Exp Res 2005;29(11 Suppl):121S-131S.4 Dooley S, Hamzavi J, Breitkopf K, et al. Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats. Gastroenterology 2003;125(1):178-91.5 Ludbrook SB, Barry
8、ST, Delves CJ, et al. The integrin alphavbeta3 is a receptor for the latency-associated peptides of transforming growth factors beta1 and beta3. Biochem J 2003;369(Pt 2):311-8.6 Annes JP, Chen Y, Munger JS, et al. Integrin alphaVbeta6-mediated activation of latent TGF-beta requires the latent TGF-be
9、ta binding protein-1. J Cell Biol 2004;165(5):723-34.7 XXXXXXXXXXXXXXXXX.2 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题2.1研究内容:2.2.1 XXXXX化学合成与鉴定,二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX 合成与鉴定。 2.2.2 不同类型脂质体的制备、技术参数优化、物理性质鉴定和脂质体药物包封率、载药量、配体结合率鉴定与提高。2.2.3 大鼠HSC分离培养,XXXXXXX 修饰脂质体与肝星状细胞体外结合活性研究。2.2.4 XXXXX 修饰XXXXXXXXX 对肝星状细胞活化、增殖、XXXXXXX 信号通路影响
10、。2.2.5 XXXXXXXXX 的药代动力学特征、组织分布特征和XXXXXXX 研究。2.2.6 XXXXXXXX 对胆总管结扎和CCl4大鼠肝纤维化防治作用。2.2研究目标:2.2.1 研究构建XXXXXXXX,为抗肝纤维化药物新剂型开发提供新型靶向载体。2.2.2 研究XXXXXX 对HSC生物活性影响及机制,为中西药结合肝纤维化双靶向、多靶点、协同治疗提供理论基础。2.2.3 研究XXXXXXXX 体内HSC靶向性及防治实验性肝纤维化的有效性,为开发中药新剂型、提高药物在靶组织浓度、降低有效剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础。2.3 拟解决的关键问题:2.3.1 高药物包封率、高配
11、体修饰率的稳定XXXXXXXX 制备。2.3.2 放射性计数法测定XXXXXX 与HSC结合活性,有效抑制HSC活化的剂量、时间参数等。2.3.3 XXXXXX 体内HSC靶向性、抗肝纤维化效果比较与评价。3 拟采取的研究方案及可行性分析3.1 研究方案:第一部分XXXXX 及XXXXX 合成(1) XXXXXX 合成及鉴定采用我们研究室建立的方法,化学合成XXXXXX。应用XXXXXXXXXX。合成反应图示如下。高效液相(HPLC)、质谱等方法鉴定合成产物纯度及分子量。反应图(略)(2) XXXXXXXXXXX采用一步法合成。XXXXXXXXXXXX。高效液相(HPLC)和质谱分析法进物产物
12、纯化与鉴定。第二部分长循环脂质体制备、鉴定与技术条件优化 (1) 脂质体制备采用经我们改良的逆相蒸发法制备。具体方法如下:XXXXXXXXXX。(2) 性质鉴定 XXXXXXXXXXXXXXXX。(3) 均匀设计优化处方 根据实验结果及文献,确定影响包封率的主要因素。以包封率为评价指标,采用二项逐步回归计算回归方程,并进行方差分析,优化条件。第三部分 XXXXX修饰长循环脂质体与HSC体外结合活性采用两步胶原酶灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC,选择静止态和激活态的HSC,接种于6孔板上(细胞密度为5.0105/mL)。待贴壁后,1%胎牛血清DMEM培养过夜,细胞同步化。(1)配体结合的浓度-
13、效应关系XXXXXXXXXXX。(2) 配体结合的时间-效应关系 (3) 竞争抑制(4) 细胞荧光定位、配体表面结合率与内吞率测定(5) 平衡解离常数(Kd )和细胞最大结合位点数(Bmax)第四部分 XXXXXXX对HSC生物学特性影响与机制采用酶法分离大鼠HSC。新鲜分离的HSC,体外培养48 h后,作为静止期HSC用于下游实验,或培养1 w后消化传代,继续培养24 h后,作为活化的HSC用于下游实验。(1) XXXXXXX对HSC活化状态影响XXXXXXXXX。(2)XXXXXX对TGF-1效应影响(3)XXXXXXXX 大鼠HSC TGF-受体XXXXXXX 信号通路影响XXXXXXXXXXXXXX。第五部分 XXXXXXXXXXXX(1) XXXXXXXX 在肝纤维化大鼠体内的器官分布(2) XXXXXXX 大鼠体内药代动力学采用XXXXXXXX。(3)XXXXXXX 在肝纤维化大鼠肝脏内分布采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。第六部分 XXXXXXX防治大鼠肝纤维化(1)造模采用胆总管结扎和CCl4肝纤维化两种动物模型。(2)分组及处理(3)治疗效果检测主要比较以下指标:XXXXXXXXXXXXXXX。3.2技术路线技术路线图(略)。3.3可行
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