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1、基因工程作业集第一章 绪论【思考题】1. 名词解释： 基因工程：基因工程是通过基因操作，利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离出感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割、加工、修饰。将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使是转基因生物获得新的遗传性状的操作。基因操作：泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。遗传工程：广义的遗传工程是指所有能改变生物遗传性状的技术，包括常规的游行杂交育种、染色体工程、细胞工程以及基因工程等。基因克隆：是指对基因进行分离和扩

2、大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝。2. 什么是基因工程？它包括哪些环节？基因工程是通过基因操作，利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离出感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割、加工、修饰。将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使是转基因生物获得新的遗传性状的操作。它包括以下几个环节：1) 目的基因克隆2) 载体的准备3) 目的基因与载体的连接4) 重组DNA转化/转染/转导5) 重组体的筛选与鉴定 3. 基因工程的基本条件有哪些？它们各自在基因工程中起着什么作用？从技

3、术流程来看，基因工程包括四个基本条件：目的基因、载体、工具酶和宿主细胞。1) 目的基因：目的基因是开展基因工程的目标和物质基础。2) 载体：外源基因往往不能自行复制，也很难稳定存在于受体细胞，需要特殊的运载工具将其引入宿主细胞才能进行复制或表达，这种工具就是载体。3) 工具酶：以DNA重组技术为基础为核心的基因工程的诞生和发展是以各种核酸酶的发现和应用为基础的，特别是限制性内切酶和DNA连接酶的发现和应用，才使DNA分子的体外切割和连接真正成为可能。4) 受体细胞：受体细胞是能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细胞。4. 基因工程的技术策略有哪些？1) 强化基因的表

4、达，改善生物性状a) 增加目标性状有关的代谢途径中限速酶基因的拷贝数，提高相应表达酶的活性，达到改善特定代谢途径的限速酶步骤以提高目标产物的含量，实现目标性状的改良。b) 使用强启动子驱动目标基因，使目标基因转录合成更多的mRNA，并翻译出更多的关键分子，进而提白哦产物的合成量。c) 提高目标途径激活因子的表达。2) 关闭特定基因的表达，改善生物性状a) 关闭目标代谢途径的抑制蛋白的编码基因或应用不受反馈抑制的突变基因。b) 阻断与目标基因途径相竞争的代谢途径。c) 基因治疗。3) 基因的异源表达赋予生物新的功能a) 具有特定功能的蛋白质编码基因的异源表达，使转基因生物能合成目标蛋白。b) 利

5、用已有的途径构建新的代谢支路。c) 专一特定途径多个酶的编码基因，使转基因生物获得新的目标产物和成新的能力。5. 基因工程的理论基础有哪些？它包括哪些主要技术？理论基础：1) 1860-1870年孟德尔根据豌豆杂交实验提出了遗传因子的概念以及孟德尔遗传规律。2) 1909年约翰逊首次提出“gene”名词。3) 1910年摩尔根的实验结果第一次将代表某一性状的基因同染色体联系起来。4) 1944年埃弗利等的细菌转化实验证实了遗传物质就是DNA，明确了遗传的物质基础。5) 1953年沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构模型。6) 1958年克里克提出了中心法则。7) 1966年Nirenberg和K

6、horena等破译了全部的遗传密码。主要技术：1) 基因转移载体的发现；2) 工具酶的发明；3) DNA合成和测序的发明；4) DNA体外重组的发明；5) PCR技术的发明。第二章 基因工程的酶学基础【思考题】1. 名词解释：核酸酶：通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核甘酸链发生水解断裂的酶。限制性内切核酸酶：简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。限制-修饰系统：限制修饰系统（Restriction modification system 或 R-M系统）是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免

7、于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。黏性末端：是指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，他们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。平末端;若限制性内切核酸酶的识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端。同切点酶：又称同裂酶，是一类来源不同的微生物、能够识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。同尾酶：有一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，是别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的粘性末端。酶的星号活性：当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性。DNA连接酶：DNAligase，是能催化双链DN

8、A片段靠在一起的3羟基末端与5断磷酸基团之间通过形成磷酸二酯键，使两端连接的一种核酸酶。DNA聚合酶：DNApolymerase的作用是在引物和模板的存在下，把脱氧核苷酸单链核苷酸加到双链核苷酸DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。5-3聚合酶活性：以DNA为模板，利用体系中的4种脱氧核苷酸（dNTP），催化单核苷酸分子加到引物的3-OH末端，沿5-3合成与模板互补的另一条DNA链，聚合作用需要Mg2+存在。3-5外切酶活性：沿3-5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，在DNA复制时起校对作用。5-3外切酶活性：是从5端降解双链DNA分子。TaqDNA聚合酶：是一种

9、耐热的依赖DNA的DNA聚合酶。反转录酶：是依赖于RNA的DNA聚合酶，或称为RNA指导的DNA聚合酶，是分子克隆中重要的核酸酶之一。末端脱氧核苷酸转移酶：不依赖模板的DNA聚合酶。碱性磷酸酶：能够催化核酸分子脱掉5的磷酸基团，从而使DNA（或RNA）片段的5-P末端转换成5-OH末端。外切核酸酶：是一类从多核苷酸链的末端开支逐个降解核苷酸的酶。SI核酸酶：来源于米曲霉菌，是一种含锌的蛋白质。脱氧核苷酸酶：简称DNA酶，是一种需要二价阳离子的内切核酸酶，能从嘧啶核苷酸5端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5磷酸末端的寡核苷酸。核酸核糖酶A：又称酶，可以特异性的攻击上嘧啶残基的端，切割胞

10、嘧啶（或尿嘧啶）与相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，反应终产物是嘧啶磷酸和末端带嘧啶磷酸的寡核苷酸。2. 型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？(一) 识别序列的特异性一般具有双重旋转对称结构的回文序列(二) 切割位点的特异性1) DNA分子酶切片段的末端a) 黏性末端b) 平末端2) 同裂酶来源不同，识别相同靶序列，产生同样的切割位点，形成同样的末端3) 同尾酶来源不同，识别不同靶序列，产生不同的切割位点，形成同样的末端。3. 什么是黏性末端、平末端、同尾酶和同裂酶？黏性末端：是指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，他们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起

11、来。平末端;若限制性内切核酸酶的识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端。同尾酶：有一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，是别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的粘性末端。同切点酶：又称同裂酶，是一类来源不同的微生物、能够识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。4. 大肠杆菌DNA聚合酶有哪些不同的酶活力特性？切口平移标记探针的步骤？(一) 该酶具有三种活性：1) 5-3聚合酶活性：以DNA为模板，利用体系中的4种脱氧核苷酸（dNTP），催化单核苷酸分子加到引物的3-OH末端，沿5-3合成与模板互补的另一条DNA链，聚合作用需要Mg2+存在。2) 3-5外切酶活性：沿3-5方向识别和切除不配对的DN

12、A生长链末端的核苷酸，在DNA复制时起校对作用。3) 5-3外切酶活性：是从5端降解双链DNA分子。(二) 切口平移探针的步骤：1) 当Mg+存在时，用低浓度的DNA酶处理双链DNA，使之随机产生单链断裂，双链DNA分子的一条链上产生切口；2) E.coli DNA聚合酶可将核苷酸连接到切口的3羟基末端，同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸；3) 由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。4) 切口平移反应受几种因素的影响:(a) 产物的比活性取决于-32 PdNT

13、P的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。5. Klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶有何异同？大肠杆菌DNA聚合酶的3个结构分别行使3个不同的活性功能，即羧基端结构域具有5-3聚合酶活性；中间结构域具有3-5外切酶活性；氨基端结构域具有5-3外切酶活性。Klenow片段具有DNA聚合酶的5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，而位于全酶较小氨基端结构域的5-3外切酶活性已被除去。6. 为什么说反转录酶是一种特殊的DNA聚合酶？其主要用途是什么？

14、反转录酶是依赖于RNA的DNA聚合酶。反转录酶普遍存在于含RNA的反转录病毒中，它以RNA为模板，催化合成互补的DNA单链，进而合成DNA第二条链。用途：1 以mRNA为模板合成其互补DNA，用于构建cDNA文库和基因克隆；2 对具5端突出的DNA片段的3端进行补平和标记，制备杂交探针；3 代替大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段或测序酶，用于DNA序列分析。7.平末端DNA片段连接的方法、技术路线？1) T4DNA连接酶；2) 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法第三章 载体【思考题】1. 名词解释：载体：能

15、携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。克隆载体：通过不同途径将承载的外源DNA片段带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。质粒载体：在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。噬菌体载体：应用噬菌体作为载体，广泛应用于大片段DNA克隆和文库构建的一类载体，代表有类噬菌体载体，M13噬菌体载体。黏性克隆载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos末端及质粒重组而成的载体。黏粒载

16、体：是针对噬菌体载体和质粒载体的不足而构建的兼具两者有点的一类载体。人工染色体：利用染色体的复制原件来驱动外源DNA片段复制的载体。质粒表达载体：是在以质粒为基本骨架的克隆载体的基础上，组装启动子、转录终止子和核糖体结合位点等表达元件而构建成的。病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，插入必要的表达载体元件所构建成的真核基因转移工具。大片段表达载体：是以大片段外源DNA为基础而构建的一类载体。RNAi：RNA干扰，是双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰。VIGS：病毒诱导的基因沉默，是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为

17、病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到整株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将内源的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的。2. 什么是克隆载体?克隆载体必须具备哪些基本条件？1) 克隆载体：通过不同途径将承载的外源DNA片段带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。2) 基本条件：1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；3 具有由单一限制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因的插入；4 具有合适的选择性标记，用于筛选。3. 表达载体需要的基本元件及其作用？表达元件主要包括：1) 启动

18、子：启动子的强弱是影响表达量的决定因素之一。2) 转录终止子：稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰的稳定的性。3) 核糖体结合位点：转录出的mRNA必须借助宿主细胞的蛋白质合成系统翻译出目的蛋白。4. 蓝白斑筛选原理？在质粒中含有LacZ基因的-肽的序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达-肽，它与宿主菌的Lac ZM15基因的产物互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；外源基因插入后，肽基因阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆）。5. 插入失活以及pBR322筛选原理1) 从原理上讲，当外

19、源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后, 使这个基因丧失了原有的功能叫插入失活(insertional inactivation) 。插入失活法是从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子（筛选）的主要方法。2) 6. Ci插入失活原理以及Spi筛选筛选原理1) 如 gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 2) 野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作

20、Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感（sensitive to P2 interference）。如果 噬菌体缺少两个参与重组的基因 red 和 gam ，同时带有 chi 位点，并且宿主菌为 rec + ，则可以在 P2 溶源性 E.coli 中生长良好，噬菌体的这种表型称作 Spi- 。因此，通过噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。第四章 基因工程的主要技术及其原理1. 提取DNA、RNA之前为什么要先进行灭菌？防止细菌污染DNA、RNA2. 提取DNA、RNA的步骤主要有哪些？需要注意哪些问题？

21、主要步骤：1) 细胞裂解和DNA的溶解2) 与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除3) DNA的沉淀及纯化需要注意的问题：在DNA的提取的过程中，细胞被破碎，DNA酶或各种氧化酶被释放出来容易导致DNA降解3. 琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电泳的原理是什么？影响因素有哪些？各有些什么用途？(一) 琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。影响因素：1) DNA分子大小2) DNA分子构型3) 凝胶浓度4) 电场强度5) 溴化乙锭（EB）6) 电缓冲液(二) 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物介质的垂直凝胶

22、电泳，可根据电泳样品的电荷、分子大小及性状的差别分离物质。适用于小分子DNA、寡聚核苷酸和蛋白质的分离。起影响因素有：电场强度、分子净电荷量、分子大小和形状以及介质的离子强度、黏度和温度(三) 脉冲电场凝胶电泳是一种交替变换电场方向的电泳，它以一定的角度并以一定的时间改变电场的方向，是DNA在微观上按“Z”字形向前泳动，从而达到分离相对分子质量大的DNA片段的目的，可使50b以上，甚至Mb级的大片段。影响的因素主要有：电场方向、电流大小及作用时间4. 分子杂交的原理是什么？有几种类型？各有什么作用？核酸分子杂交实际上是双链或者具有二级结构的变性之后，其具有互补序列的两条单链的退火复性过程。分子

23、杂交技术可用于重组子鉴别、基因分离、片段分析、基因表达研究等。5. PCR的反应步骤有哪些？PCR反应体系含有哪些基本成分？主要步骤：变性、退火、延伸。成分：缓冲液、模板、耐热的聚合酶、引物6. PCR设计引物的原则有哪些？1) 长度：引物长度一般为为宜，最佳为，不形成稳定的复合体。2) 含量一般为为佳。3) 两个引物之间不应发生互补。4) 引物内部避免形成次级结构，尤其是发夹结构。5) 引物的延伸从端开始，端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能，末端最后一个碱基最好是或。6) 引物的端限定着产物的长度，他对扩增的影响不大。7) 引物端不要终止于编码区域密码子的第位，因为密码子的第

24、位容易发生兼并，会影响扩增特异性和效率。7. DNA测序有哪些方法？它们的原理是什么？1) 化学降解法：首先放射性标记待测序的一端，并将其分为份，分别用不同的化，学试剂进行种裂解反应，每种反应之断裂某一种或某一类碱基，结果可产生种起始于放射性标记末端的不同长度的标记分子，经变性凝胶电泳分离各组不同大小长的片段，并进行放射自显影，可根据光片上所显现的相应普带，读出的核苷酸序列。2) 双脱氧链终止法：DNA聚合酶能利用单链为模板，离体合成其互补链，当反应液中，双脱氧核苷三磷酸（），它可以像脱氧核苷三磷酸（）那样直接掺入新合成的链中，但因端不具，所以寡核苷酸链不再继续延长，即链合成终止。在个反应管中

25、同时加入同一种合成的被标记的引物和待测序的模板、聚合酶、种脱氧核苷三磷酸（、），并在这个管中分别加入种不同的，双脱氧核苷三磷酸。反应将产生不同长度的DNA片段混合物，他们都带有ddNTP的3末端。将这些混合物进行变性凝胶电泳分离，就可以获得一系列不同长度的DNA普带。再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。最后可以在放射性光底片上，直接读出序列。3) 的自动测序：基于双脱氧链终止法测序原理，也是通过个酶学反应利用产生一系列一端固定、另一端终止于不同、碱基位点的DNA片段。8. DNA序列分析有哪些内容？可采取哪些方法进行？1) 基因拼接及结构分析2) 核酸序列的同源性检索3) 基因功

26、能注释及表达分析第五章 目的基因的获得1、 名词解释：末端的快速扩增，一种根据抑制部分cDNA序列扩增未知序列PCR的技术。简并序列：一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列。反向PCR：PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。：热不对称交错，是获得已知序列侧翼未知序列的一种衍生方法。基因组文库：是将某一类生物基因组片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。文库：是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录形成，并全部克隆成重组子的一类群体的总称。PCR：是基于的差异显示技术。：一种cDNA代表性差异分析技术。：一种表型克

27、隆技术。PCR：一种RNA任意引物的PCR技术。2、 目前利用基因差异表达获得目的基因的技术主要有哪些？其技术原理是什么？他们各自有什么优点和缺点？（见P124）1) 差异显示PCR：2) 代表性差异分析：3) 抑制性消减杂交：4) RNA任意引物PCR3、 cDNA第二条链的合成方法？1) 自身引物合成法：cDNA/mRNA杂合体用碱处理后获得单链cDNA，随即在3端形成一个短小的发夹结构，次发夹结构可以作为引物合成第二条链。最后用SI核酸酶处理除去末端发夹结构，但5端部分序列会因此而失去。2) 置换合成法：RNaseH在mRNA上产生缺口（内切作用）残存的可以作为合成第二条链的引物，最后用

28、连接酶连接修复缺口。通过这种方法可以获得近乎全长的。3) 引导合成法：降解杂交链中的，然后用末端转移酶在端加聚尾巴，以（）为引物合成第二条链，这种方法可获得全长的。4、 从mRNA入手获得基因全长的方法？第六章 DNA重组的操作1、 名词解释：体外重组：是指将目的基因（外源DNA片段）用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上形成重组DNA。同聚物加尾法：利用末端转移酶催化在单链或双链末端加上互补同聚物尾巴。衔接物：指人工合成的一段由组成、具有一个或数个限制性核酸内切酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片段。转化：指以质粒为载体，将外源DNA导入处于感受态的大肠杆菌等原核宿主细胞，并使其获得新

29、的表型的过程。感受态细胞：指处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。感染：将以噬菌体DNA为载体的DNA重组子分子包装成病毒颗粒，使其感染受体菌的过程。转导：有噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程。转染：以噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用连接酶使噬菌体环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。筛选：指通过特定的方法，从被转化的细胞群体或基因文库中，鉴别出真正具有重组分子的阳性克隆的过程。2、 外源片段与载体DNA的重组主要有哪几种方法？各有何优缺点？1) 粘性末端的连接：2) 平末端的连接：3) 产物的连接：4) 载体构建系统：3、 如何防止线状DNA分子的自身环化?4、 如何将一段平末端的片段与形成的粘性末端连接？5、 简述制备细胞感受态转化重组的原理？6、 重组子筛选主要有哪些方法？1) 载体表性选择法：2) 根据插入基因的表型选择法：3) 电泳检测法：4) 检测法：5) 核酸杂交检测法：6) 免疫化学检测法：7) 序列分析：7、 为什么系列的载体与外源基因形成的重组体可用蓝白斑实验筛选？8、 某一质粒载体有和的表型，在中有一的酶切位点，现用切割载体进行基因重组，问如何用抗性变化筛选含有插入片段的重组体？