分子生物学实验常用工具酶总结Word格式文档下载.docx

1、命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母（小写）+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称ArthrobacterluteusAlu EscherichiacoliRY13EcoR BacillusamyloliquefaciensHHamH HaemophilusinfluenzaeRdHind （一）三种常用内切酶1.型限制性内切酶 同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。 在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。若DNA双链中有一

2、条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。 （实际上，有内切酶、修饰酶、ATP酶及解旋酶四种功能） 型限制性内切酶在DNA链上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。没有时间应用价值。1.2.3.种内切酶可以切割，而另一种不能。如：Hpa和Msp 识别顺序都是5CCGG3，若其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Msp酶可切割（GGmCC）。4.Subset酶： 识别顺序及切割位点相互有关的酶，互称Subset酶。Sam酶所识别的6个核苷酸顺序中含有Hpa酶识别的4个核苷酸顺序。所以这两个酶可以相互代替使用，它们所切割的DNA片段可以相互连接。5.可变酶（

3、特殊的）：识别核苷酸顺序一般都大于6个，但其中一个或几个核苷酸时可以变化的。6.远距离切割酶：识别核苷酸顺序的位置与切割的位点不一致，一般切割位点与指标核苷酸顺序的位置之间有10个左右核苷酸的距离。 与型内切酶相似，不过型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些。 （三）甲基化酶（不属于内切酶） 使识别顺序中的某个核苷酸发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。M5C（5-甲基胞嘧啶）大多数以M5CpG的形式存在，即CpG岛中的C最容易是甲基化的底物，而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关。因此，研究CpG岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向。当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时，常常可以使

4、有多个识别位点的内切酶只对其中一个识别位点有切割效果，其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割。限制性内切酶Ava的识别顺序是 Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。因此可以有4种识别顺序。如果同时使用甲基化酶Taq和甲基化酶Hpa，则Ava的识别顺序将只是5CCCGAG3。 如上图，一个基因片段被Ava酶切割时，片段中有三个Ava酶识别顺序，该片段被切割成4个片段。 但若先用Taq甲基化酶和Hpa甲基化酶作用该片段时，片段中某些核苷酸发生甲基化修饰而不能被切割，再用Ava酶切割时，只能被切割成两个片段。【一甲基化酶对DNA的某位点进行甲基化修饰，进而抵御内切酶的切割构建重组质粒】（四）

5、与 内切酶相关的几个概念 1.酶活性单位及标准反应体系 酶活性单位：在一定温度、PH及离子强度下，1h内完全酶解（切割）特定底物DNA，所需限制内切酶的量。 （底物DNA：多用噬菌体DNA。又是可以用某一种酶在噬菌体DNA上的切割位点，来推算用这种酶切割这种DNA时所需的活性单位。）标准反应体系：在50l反应体系及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用1个活性单位的限制内切酶，酶解1g底物DNA反应1个小时。 （若底物比1g多或少，可参照标准体系比例增加或减少酶用量。但增加酶用量时，需注意不可加量过多内切酶中通常含有甘油防冻剂，加入酶量过多，其中的甘油会降低内切酶识别顺序的特异性。 也可通过延长反

6、应时间来保证完全的酶切。2.星号活力限制性内切酶在非标准反应条件下，切割一些与特异性识别顺序相类似的顺序活性（该酶的第二活性）。 （产生许多不想得到的片段；内切酶的识别切割能力下降，识别特异性下降。引起星号活力的因素：过高的甘油含量（5%）；低盐离子强度（25mmol/L）；高PH值（8.0）；含有有机溶剂；含有非Mg二价离子；酶量过大（酶解1g底物DNA用的内切酶大于100个活性单位）。3.限制性内切酶底物位点优势效应限制性内切酶对同一DNA片段切割时，在对其可以识别的位点上表现出不同的切割速率的现象。4.限制性内切酶质量有良好的酶活性；不存在任何其他核酸内切酶和外切酶的污染；长时间的酶切反

7、应不发生识别顺序特异性的降低；被某一酶切割后的DNA经重新连接后，仍能被同一酶再次识别并再次切割。内切酶质量的鉴定：50l反应体系中以等量内切酶分别以1h和12h（过夜）时间来切割底物DNA，用凝胶电泳检查酶切结果。若不出现条带数目的差别，则内切酶质量好。在T4DNA连接酶作用下，重新连接被内切酶切割后的DNA片段，再用同一酶切割，若所产生的DNA片段的大小和数目和第一次切割的结果完全一样，则说明酶的质量好。 可鉴定是否混有其他内切酶和磷酸脂酶（DNA被内切酶切割后，只有各个片段的3OH和5P基团完好才能再次连接，连接的DNA仍能提供同一酶的相同切割位点，才会出现上面所说的两个完全相同的结果。

8、二、DNA重组常用的其他酶类（一）DNA聚合酶（DNA polymerase） 将一个脱氧三磷酸核苷酸加到引物（primer）的3-OH上，再释放出一个焦磷酸分子（ppi）。1.大肠杆菌DNA聚合酶（E coli DNApolymerase） 聚合酶、聚合酶、主要参与DNA修复，主要参与DNA复制。三种都有沿模板按53方向合成互补DNA链的活性和按35向的外切酶活性。聚合酶还有53向的外切酶活性。53聚合酶活性：填补DNA链上的缺口，或参与修复DNA合成过程中切除RNA引物后留下的空缺部分。35外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。53外切酶活性：切除受损的DNA部分 Klenow酶：

9、大肠杆菌DNA聚合酶（109000Da）经舒替兰酶（枯草杆菌蛋白酶）水解获得的76000Da片段。具有53聚合酶活性和35外切酶活性。可用于填补DNA单链末端成为双链。 可用于合成cDNA第二链。 当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli聚合酶I就可以将核苷酸连接到切口的3-OH末端。同时该酶具有53的核酸外切酶活性，能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸，从而使切口沿DNA链向3端移动。【切口平移：切口产生3羟基和5磷酸基团，DNA延伸合成3端，5端被小片段降解，缺口位点沿着双链向3端移动，是在体外向DNA分子引入放射性标记核苷酸的技术。】2.噬菌

10、体DNA聚合酶T4 DNA聚合酶，也具有53聚合酶活性和外切酶活性。外切酶活性比大肠杆菌DNA聚合酶外切酶活性强200倍。 可用于探针的放射性核素标记。3.噬热水生菌DNA聚合酶从噬热水生菌Themus aquaticus YT-1菌株中分离得到。 耐热其中Taq DNA聚合酶使用最多。 7075生物活性最高。在7580条件下，每个酶蛋白分子每秒可以延长150个核苷酸被广泛应用于体外扩增特异性DNA片段的技术（聚合酶链式反应，PCR）（二）RNA聚合酶能利用DNA作为模板，催化四种核糖核苷三磷酸（NTP）底物合成RNA。 :核仁中，转录rRNA顺序 ：细胞质中，转录大多数基因（蛋白质基因和部分

11、核内小RNA基 因），转录是需要“TATA”框（酶开始结合的位置，启动子， 型转录单位特有的）。细胞核质中，转录tRNA、5SrRNA基因等少数几个基因。 （核质：由单一密闭环状DNA分子反复回旋卷曲盘绕组成的松散 网状结构。 无核膜、核仁）（三）DNA连接酶 基因工程比用的工具酶 T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase） Mg2+依赖性酶 催化双链DNA上具有相邻的3羟基和5磷酸末端单链缺口的修复，以及具有黏性末端或平端的DNA片段的端端连接的酶。DNA连接既可发生在DNA分子之间，也可发生在分子内部。 高浓度的DNA末端有利于分子间连接，低浓度则有利于环状DNA分子的形成。DNA连

12、接酶只能连接双链DNA而不能连接单链DNA。（四）反转录酶（逆转录酶，reverse transcriptase）以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。以RNA为模板时，在反转录酶作用下，先合成单链DNA（ss DNA）。再在反转录酶和DNA聚合酶I作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA（ds DNA）。最后在核酸酶S1作用下，切割成两条单链DNA。需要Mg2+、Mn2+作为辅助因子。反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的DNA。 可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。（五）核糖核苷酸A（RNase A，r

13、ibnuclease A）核酸内切酶。 特异的攻击RNA上嘧啶残基的3端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，产生3-磷酸嘧啶核苷酸和以3-磷酸嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸（一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称。 寡核苷酸可以很容易地与它们的互补对链接，所以常用作探针确定DNA或RNA的结构）。高浓度时，可对单链RNA的任何位点进行切割；低浓度时，只切割C和U的位点。检测寡核苷酸片段中是否含有C和U。有显著的细胞毒性。RNase A可用于检测基因突变：利用RNA探针与突变基因形成RNA-DNA杂交体时，突变点处不能产生碱基互补（局部单链）这一特点，用RNase A进行切割，切割产物可通过跑变性胶得到分离，可用放射自显影等其他方法检查片段数目及大小，从而推知发生突变的位点。 RNA探针可通过将相应的DNA片段克隆至含有SP6或T7启动子的载体中得到。在操作RNA的实验时一定要戴口罩和手套（RNase A存在非常广泛，人唾液、汗液中均含有），以避免有RNase的污染，所用的容器及蒸馏水也都必须经去RNase处理。【用DEPC处理：0.1100比例加DEPC，37