重组质粒的构建转化筛选和鉴定 2分解Word格式.docx

1、双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒变成两段线状DNA了片段，双酶切前期酶切操作复杂，但是重组效率高。本实验所选用的限制酶是Hind ，选用方法是单酶切法。DNA连接反应是利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起，成为一个完整的重组分子的反应。当载体DNA和外源DNA末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话（同尾酶也可以），或者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴，那么经退火后可形成新的重组分子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源DNA两端的限制性内切酶切点，从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的DNA段。本实验所选用的连接酶是T4连接

2、酶。转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表现型发生相应变化的现象。为了检验连接产勿，需要对转化子进行筛选，本实验将重组质粒导入大肠杆菌，用氨苄抗性的选择培养基对转化子进行筛选；通过红白斑反应对重组子进行筛选。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质，具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可

3、以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定 和 纯化DNA片段。为了进一步验证重组质粒的类型，本实验进行了如下后续实验：菌落PCR、进一步的酶切反应、和一系列的DNA电泳（对菌落PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳、重组质粒的1%琼脂糖凝胶电泳、酶切重组质粒的1.2%琼脂糖凝胶电泳），最终从电泳图中确定出酶切产物的片段大小。正文1.材料和方法1.1 材料和试剂实验材料：PUC19质粒，E.coliDH5。实验试剂：Hind 核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶，琼脂糖，TEA，质粒提取试剂盒，buffer，PCR引物，ddH2O，CaCl2，麦康凯培养基，LB液体培养基等。1.2实验

4、方法1.限制性核酸内切酶的酶切反应（1）分别在1.5ml离心管中按照表1表酶切反应体系按顺序加入各组分，每组都需要酶切自己组提出的pUC19质粒，韩霜酶切 DNA（商品），王帅酶切pUC19（商品）。加样序号反应体系成分pUC19（各组） DNA（商品）pUC19（商品）体积（L）1ddH2O13.069.062.0210M buffer2.010.08.03DNA4.015.04Hind （15U /L）1.06.0共计20.0100.0（50+50）80.0（40+40）表1 酶切反应体系（2）每组样品混匀后4000rpm,1min离心，将液体集中于管底（3）在37水浴12h后,将溶液存放

5、在-20以待下次电泳使用。2.第一次材料准备（1）每组将1.5mL离心管若干放入500mL三角瓶中灭菌；（2）全班用100 mL三角瓶装2瓶20mL无菌水以待高压灭菌（3）全班配置用2个量筒（以及搪瓷杯）配置LB液体培养基共2000ml ，并进行如下分装：25ml/100ml三角瓶20瓶，50ml/300ml三角瓶6瓶,100ml/300ml三角瓶12瓶（加入1.3%的琼脂，即15.6g琼脂）,放入高压锅灭菌。（4）把使用的枪尖盒装满、包好，做好“黄蓝”标记，高压除菌；3.对酶切产物进行1琼脂糖凝胶电泳（1）正确组装制胶槽、制胶板、18尺的样品梳（制两块胶）；（2）取80mL1TAE至250m

6、L红盖试剂瓶中；再称0.8g琼脂糖，倒入瓶中，轻旋混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒；（3）待溶液冷却至60左右，加入40L 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5mg/mL，混匀后倒入制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。（4）每组取1个1.5mL离心管，加入8L反应体系的酶切反应液和2L 6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。韩霜取1个1.5mL离心管，分别加入4L 反应体系的DNA（商品）酶切反应液和1L6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。王帅取1个1.5mL离心管，分别

7、加入4L 反应体系的pUC19（商品）酶切反应液和1L6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。老师取1个1.5mL离心管，分别加入4L 反应体系的pUC19（商品test）酶切反应液和1L6/10x Loading buffer，用微量移液器吹吸混匀。（5）待胶冷却完毕，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1TAE电泳缓冲液）将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1TAE至高出胶面约1mm；（6）将上述混合好的DNA样品，按照表顺序，点样到上样孔中（13韩霜点样；26王帅点样，其他上样孔各组点各自的样）。表2酶切反应电泳上样顺序泳道5678样品/Hind DNA

8、/ Hind（Test）pUC19（商品）/ Hind （对照）pUC19（商品）/ Hind （T）1组pUC19/ Hind 2组pUC19/ Hind 样量5.0L10.0L9101112131415163组pUC19/ Hind 4组pUC19/ Hind 5组pUC19/ Hind 6组pUC19/ Hind 7组pUC19/ Hind 8组pUC19/ Hind 9组pUC19/ Hind 10组pUC19/ Hind （7）开启电泳仪电源，选择合适的电压120V和时间40min；（8）将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪

9、负极相连；（9）启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开；（10）电泳结束，关闭电源，取出凝胶，在紫外灯下观察电泳条带。4. 第二次材料准备（1）每个500 ml三角瓶配制250ml 麦康凯培养基，共配制12瓶。（除第2大组多配两瓶，其余每个小组各配1瓶）：取13g麦康凯琼脂，重蒸水溶解、定容至250mL，高压除菌；（2）包装14套培养皿，每套12个皿，高压除菌；（3）准备6盒无菌牙签与100ml 烧杯，中高压除菌；（4）准备12组无菌试管，每组4支，高压除菌；（5）将无菌Ep管塞满到500ml三角瓶中，高压除菌；（6）把使用的枪尖盒装满、包好，做好“黄蓝”标记，高压除菌；5.载体与外源DNA

10、的连接反应（1）分别在1.5ml离心管中按照表3表酶切反应体系按顺序各组分，其中3组和10组用的是自己提的pUC19质粒，其他组用商品化的pUC19质粒。每组都用自己提的 DNA。表3 连接反应体系加样顺序成分3.2T4 Ligase BufferpUC19/Hind 2.0（50ng） DNA /Hind 3.0（135ng）T4 DNA Ligase（350 U/L）0.8合计（2）每组样品混匀后，4000rpm离心1min，集液于管底。（3）将样品至于16条件下过夜。6. E. coli受体菌DH5的准备（1）倒LB平板，划线活化E.coli 受体菌DH5；（2）挑取单菌落至5mL LB

11、液体中，37C振荡培养过夜；（3）将过夜培养物按1%转接至新鲜20mL LB液体，37C，220rpm培养2-2.5hr后，将菌液置于冰浴中。7.平板制备每组倾注12个麦康凯培养基平板，其中1组做不加氨苄的对照组，其他组都做加氨苄的实验组。（1）将热的麦康凯培养基室温冷却至55-60C左右；（2）加入终浓度100g/mL的Amp 250l（1组不加）于培养基中；（3）无菌操作倒平板12个。8.制备E. coli感受态细胞（1）用搪瓷杯取满冰（2）取2个1.5mL Ep管，分别加入1.5mL E.coliDH5菌液，4离心机4000rpm, 5min离心，弃上清；（3）利用Ep管中残留液体涡旋细

12、胞；（4）分别向2个Ep管中加入800L预冷的0.1M CaCl2;（5）冰浴悬浮细胞；（6）用4离心机4000rpm，5min离心，吸弃上清；（7）分别向2个Ep管中加入100L冷0.1M CaCl2，用枪尖轻轻吹悬细胞；（8）冰浴20 min;（9）将其中一管的液体取50L至一新的Ep管，做好标记“3”，剩下的残留50L的管标记为“2”，没有分装的装有100L感受态细胞的标记为“1”。此时感受态细胞制备完成（现用或者48小时内使用，4存放）。9.连接产物转化E. coli感受态细胞（1）按照表4的步骤由1到7进行实验。表4连接产物转化E. coli感受态细胞步骤步骤17实验设组感受态细胞（