凝胶层析法测蛋白质分子量Word文件下载.docx

1、（三） 凝胶 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔网状结构。常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose），人工合成凝胶是葡聚糖（dextran，商品名为SePhadex），凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。（四） 测量方法 凝胶过滤层析, 是一种分离不同大小分子的分配层析, 被分离物质的分子在溶剂

2、和限定孔径的凝胶固定相中被分配, 混合物随流动相流经层析柱时, 各种物质同时进行着垂直向下的运动和无定向的扩散运动, 混合物中各物质因相对分子质量的大小不同而被分离, 这种方法操作简便, 费用较低, 重复性好8。因其能像筛子一样筛分不同大小的分子，因此又称为“分子筛”。其具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分析中被广泛采用。经过不少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种可靠的测定高分子分子量的方法9。 将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt（total volume）表示。Vt由三部分组成，即Vt=Vo+Vi+Vg。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水

3、体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积。而洗脱体积（Ve，elution Volume）与Vo及Vi之间的关系为： Ve=Vo+KdViVe是自加入样品时起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；本实验凝胶层析柱中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时，大分子的蛋白呈正态分布连续首先流出，会形成一个蛋白峰10。Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说K

4、d是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。Kd可通过实验求得： Kd=（Ve- Vo）/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（带颜色为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求出；Vi可由gWR求得（g为干凝胶重，单位为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示）。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积Ve，就可算出它的Kd值。三、实验器材1试剂 （1）标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000（200KD

5、），牛血清清蛋白（67KD），胰凝乳蛋白酶原（24.5KD），CytC（13.7KD），均为分析纯。 （2）洗脱液：0.2mol/L Tris-HCl-KCl,pH7.5 取0.5M KCl 20ml,0.2M Tris 25ml,0.1M HCl40.3ml,再加H2O定容至100ml （3）Sephadex G-75 2.器材 （1）层析柱：柱管1.250cm （2）紫外分光光度计 （3）部分收集器（4） 刻度试管四、实验步骤1.凝胶的选择与处理：本实验使用Sephadex G-75凝胶。商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前需在欲使用的洗脱液中充分溶胀。即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐

6、渐升温至近沸，一般12h即可完成11。根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积计算所需凝胶干粉的重量，然后倾入过量的洗脱液中，室温吸水膨胀。凝胶颗粒最好大小均匀，这样流速稳定，结果较好。2.装柱：本实验所用层析柱的规格为1.250cm。（1）将层析柱垂直装好，在柱内先注入1/41/5的水，出口处接上一根长约1.5m，直径2细塑管，塑管另一端固定在柱的上端约45处。然后打开机器，排出气泡。（2）随着下面水的流出，上面不断加凝胶，使形成的凝胶床面上有凝胶的连续下降。（3）当凝胶沉积到柱的顶端约6处，可停止装柱。（4）用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不均一，必须重新装柱。

7、3.加样：加样之前先吸去柱管内的上清液，然后加样。等到所加的样与凝胶界面相平时，连接恒压瓶、层析柱、部分收集器等装置。4.洗脱：待上述工作做好之后，开始洗脱。洗脱时应严格控制流速，以34分钟收集3ml液体为宜。然后用部分收集器按每管3mL收集洗脱流出液，各收集管于280nm处检测A280值。 5.洗脱曲线、标准曲线的制定 （1）按上述步骤依次加入蓝色葡聚糖-2000（200KD）、牛血清清蛋白（67KD）、胰凝乳蛋白酶原（24.5KD）和CytC（13.7KD），然后用50 mmol/l的KH2PO4-K2HPO4缓冲液溶液洗脱。待上一个样品在管柱中行进约1/3时再加下一个样。用部分收集器收集

8、流出液体，然后用紫外分光光度计于280nm处测定每管A值，以管号或者洗脱体积为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线。 根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve。然后以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。为了结果可靠，应以同样条件重复1-2次，取Ve的平均值作图。五、 实验结果1. 洗脱曲线：本实验共依次加入4种分子量已知的蛋白质，分别为A:蓝色葡聚糖-2000（200KD）、B:牛血清清蛋白（67KD）、C:胰凝乳蛋白酶原（24.5KD）和D:CytC（13.7KD）。每34分钟收集3ml液体为一管，共收集了25管，每管在280nm处测得的吸光度值A值（即OD值）见

9、表1：表1：每管洗脱液对应的OD值管号12345OD值0.020.0370.0410.3180.146789100.0360.0060.3260.0890.05311121314150.0190.0240.060.2860.34416171819200.220.0780.0310.10521222324250.1840.1340.0910.0470.023因此，以管号为横坐标，OD值为纵坐标绘制的洗脱曲线见图1：由表1算得4种样品的洗脱体积分别为:Ve（A:蓝色葡聚糖）=（3+0.5）3=10.5mlVe（B:牛血清清蛋白）=（8-3-0.5）3=13.5mlVe（C:胰凝乳蛋白酶原）=（15

10、-7-0.5）3=22.5mlVe（D:CytC）=（21-11-0.5）3=28.5ml2. 标准曲线：以蛋白质分子量的对数（1gM）为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。表2:各样品洗脱体积和lgM值样品MlgMVeA2000005.301 10.5B670004.826 13.5C245004.351 22.5D137003.876 28.5图1：加入的4种分子量已知的蛋白质的洗脱曲线，由上图可知：分别在第4、8、15和21管时出现峰值。图2：加入的4种分子量已知的蛋白质的标准曲线六、 分析讨论蛋白质是生命过程中最重要的物质之一 , 早已成为生命科学领域的研究热点。而分子量是蛋白质的主要

11、特征参数之一,故准确测定其分子量意义重大。凝胶层析法在蛋白质分子量的测定方面，虽然不及聚丙烯酰氨凝胶电泳的灵敏度及准确度高，但因其操作简便、试剂价格较为便宜等优势而受到人们欢迎。影响分子量测定准确性的因素众多，有一定的局限性。如缓冲液的pH值、凝胶的型号、加样时间间隔、顺序，以及收集洗脱液的操作等等都会对实验结果产生影响。缓冲液的pH值在6-8时，所得的标准曲线的线性较为良好，本实验所用的缓冲液的pH值为7.5，在该范围之内，故在其他操作良好的情况下所得的线性较为良好。凝胶的型号对分离的准确性产生影响。比如Sephadex G-100 和Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱, 前者可在前期去

12、除相对分子质量较大的杂蛋白，而后者的分离范围只有1000-30000。我们的目标蛋白相对分子 质量在10000-200000左右, 故用Sephadex G-100或者Sephadex G-75 可得到较好的分辨率。 加样时间间隔、顺序对结果准确性的影响。本实验采取加入单一样品的方法，按分子量由大到小加入，并且待上一个样品基本上快要走出柱管时才加下一个样。分子量大的样品不能进入凝胶内部，在凝胶颗粒之间的缝隙流出，因此速度最快。从大到小加样，可以保证前一个样品基本上被分离出来，确保了会出现峰值，能得出较为准确的洗脱体积。 分光光度计使用波长为280nm时，是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长。故本实验测定蛋白质的分子量使用280nm。七、 注意事项1. 加样时按分子量由大到小加入，以便于出现峰值和计算洗脱体积。2. 洗脱液的pH值应在6-8得范围内，以保证标准曲线的良好线性。3. 加样之前应赶