医学答辩：1---医学毕业论文答辩-PPT资料.ppt

1、,本研究采用四动脉结扎（4-VO）全脑缺血模型，观察GPC对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论依据。,研究的背景及意义,第二部分材料与方法,PART 02,02,大鼠脑立体定位仪大鼠脑微量注射泵冰冻切片机激光扫描共聚焦显微镜酶标仪电泳设备摇床Morris水迷宫超低温冰箱等,组织裂解液BCA蛋白浓度测定试剂盒eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相应的二抗NBT/BCIP显色液 NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及对应的荧光二抗TUNEL试剂盒,材料与方法,SPF级成年雄性SD大鼠,随机分组及4-VO模型,材料与方法,再灌注5d检测海马

2、CA1区神经元的凋亡及存活,实验方法及检测指标,再灌注30min,6h,1d,3d 观察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表达,免疫荧光染色法,蛋白免疫印迹技术,TUNEL染色及NeuN染色,再灌注3d观察海马CA1区神经元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋白的表达及定位,Morris水迷宫,再灌注7-9d，检测大鼠的空间学习和记忆能力,材料与方法,数据整理后，应用SigmaStat3.5统计软件进行统计学分析。所有计量资料数值以均数标准差表示，采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法（LSD），各实验组之间比较采用q检验（Newman-keul

3、s test），P 0.05为差异有统计学意义。,材料与方法,第三部分实验结果与讨论,PART 03,03,图1、NeuN及TUNEL免疫荧光染色观察再灌注5d大鼠海马CA1区神经元的存活及凋亡,A,B,C,实验结果与讨论,图A：NeuN（红色）染色：生存的神经元；TUNEL（绿色）染色：凋亡样神经元；图B：海马CA1区1mm 长度内NeuN 阳性神经元数量统计图；图C：海马CA1区1mm长度内 TUNEL阳性神经元数量统计图;*P0.05 vs.I/R 组，#P0.05 vs.GPC 组，n=5;40,bar=50m,小结 1 Genistein后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用，eNOS

4、激酶抑制剂L-NAME减弱了该作用，说明eNOS可能参与了此保护作用。,Genistein后处理是否诱导eNOS激活（磷酸化）?,实验结果与讨论,图2 GPC对大鼠海马CA1区神经元eNOS、p-eNOS蛋白表达的影响,图A：再灌注不同时间点p-eNOS、eNOS蛋白的表达；Sh：Sham组；R：再灌注；：I/R组；GPC组；GPC:Genistein后处理；p-eNOS蛋白表达统计图：n=4；*p0.05 vs.I/R组,A,B,实验结果与讨论,A,B,实验结果与讨论,图3 L-NAME对再灌注3d大鼠海马CA1区神经元eNOS磷酸化水平的影响,图A：各实验组再灌注3 d p-eNOS蛋白表

5、达；各实验组再灌注3 d p-eNOS蛋白表达统计图，n=5，*p0.05 VS.I/R 组；#p0.05 VS.Vehicle2 组,小结 2Genistein后处理可诱导全脑缺血大鼠海马CA1区eNOS磷酸化水平升高，eNOS激酶抑制剂L-NAME可有效降低GPC诱导的eNOS磷酸化水平。结果揭示：eNOS磷酸化水平升高参与了Genistein的神经保护作用。,Genistein后处理是否能有效降低缺血再灌注后神经元的氧化应激损伤呢?,实验结果与讨论,图4 全脑缺血再灌注3 d，各实验组大鼠海马CA1区4-HNE及8-OHdG免疫荧光染色,A,图A：绿色:NeuN；红色:4-HNE；DAP

6、I；8-OHdG；n=4-5；40；bar=50 m,实验结果与讨论,小结 3 GPC能有效降低氧化应激损伤；eNOS激酶抑制剂L-NAME废除了此神经保护作用。,Nrf2/ARE信号是生物体内抗氧化应激反应最重要的内源性防御系统。那么，GPC是否通过eNOS诱导了此信号通路?,实验结果与讨论,C,图5 A-C GPC促进大鼠海马CA1区Nrf2蛋白表达,图A：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达；再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达统计图，n=4，*p0.05 vs.I/R组；再灌注3d 各实验组Nrf2 蛋白的表达及统计图；*p0.001 vs.I/R组，#p0.001 vs.Vehicl

7、e2 组,A,实验结果与讨论,图5 D 免疫荧光染色法观察大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内Nrf2 的表达及定位,绿色：Nrf2；黄色：二者的共定位；bar=30m.,L-NAME,实验结果与讨论,图6 大鼠再灌注3d海马CA1区神经元内HO-1蛋白表达及其与Nrf2的共定位,图A-B：HO-1蛋白表达及其统计图；HO-1与Nrf2蛋白的共定位，*p0.05 VS.I/R 组；#p0.05 VS.vehicle2组；绿色：红色：HO-1；蓝色：合成图为三者的共定位；bar=50m；,实验结果与讨论,小结 4,实验结果与讨论,海马是学习和记忆的重要部位，而海马CA1区是缺血最敏感的区域。那么，

8、GPC是否能改善大鼠缺血后空间学习记忆能力?,GPC可显著增加海马CA1区神经元胞核中Nrf2蛋白的表达并引起下游靶基因HO-1的表达，而L-NAME阻断了此作用。此结果进一步揭示GPC通过eNOS诱导了Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤。,图7 GPC对大鼠缺血后空间学习和记忆能力的影响,图A-B：潜伏实验和探索实验统计图；n=5；*p0.05 vs.I/R组；#p0.05 vs.GPC 组.图C-D：潜伏实验和探索实验大鼠游泳路程轨迹图,D,C,实验结果与讨论,小结 5 GPC能有效的改善大鼠缺血后的空间学习和记忆能力。,实验结果与讨论,第四部分总 结

9、,PART 04,04,总结,第五部分不足与展望,PART 05,05,不足与展望,第四部分致 谢,PART 04,04,实验和论文的最终完成是我的导师*教授精心指导的结果。谨借此机会，向我敬爱的恩师表示最衷心的感谢！感谢河北联合大学研究生学院、基础医学院病理教研室以及形态中心的各位老师所给予我的指导、关心与包容！感谢在学习及生活中曾经与我朝夕相处、共同努力、不懈追求的同学和朋友们！感谢我的父母、亲人和工作单位对我的支持与鼓励，正是他们的理解和关怀使我顺利的完成学业！,致谢,医学毕业论文答辩,研 究 生：XX教授,Genistein后处理介导大鼠海马CA1区eNOS/Nrf2/HO-1信号通路及其神经保护作用,2019,MEDICAL THESIS DEFENSE,