cdna的第一链合成反转录优质PPT.pptx

1、重组cDNA分子的导入和克隆。,第一节 将RNA转变成cDNA,一、mRNA的分离纯化,1.总RNA的提取RNA不稳定：核糖环上的2OH促使对磷酸二酯键的亲水性攻击。,异硫氰酸胍法：异硫氰酸胍可裂解细胞，使RNA与蛋白质 分离，将RNA释放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA 进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）为RNA，有机层（黄色）为DNA和蛋白质。,RNA酶的降解,RNA分子不稳定,RNA易遭降解,RNA分子结构,RNA抽提,2、mRNA的分离纯化mRNA只占总RNA的1%-5%。原理：利用mRNA都含有一段polyA尾

2、巴，将mRNA从 总RNA中分离纯化。方法：寡聚（dT）-纤维素柱层析法。,mRNA纯化,二、cDNA合成,cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为 cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引 物引导，常用引物是oligo dT。第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催 化。,cDNA的第一链合成,反转录：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程 中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。禽类成髓细胞瘤病毒（AMV）的反转录酶一类能引起鸟类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。其反转录酶由一个亚基和一个亚基组成，有二种酶活力。1

3、）RNA指导的DNA聚合酶活力。2）RNaseH酶活力，水解RNADNA杂种分子中的RNA，可 沿35和53两个方向起外切酶作用。,莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV）的反转录酶此酶是一条单一的多肽链，有RNA聚合酶的活性，RNaseH的活性减弱。,引物,1、Oligo dT引物,2、随机引物（六聚体寡核苷酸）这种非特异性引物可沿着mRNA多个位点结合3、特异性引物。,mRNA反转录酶,3AAAAAAA5TTTTTTTcDNA,5,在总的RNA 中可作为具有 mRNA的特异 引物,文库不能完全 包含基因编码 序列,产生一个大的 具有特定序列 的 cDNA文库,cDNA产物可能 是小的，不具有 多聚

4、腺苷的模板 也被可利用,可产生大量特 定基因的 cDNA文库,产生的cDNA 文库应用范围 有限,第一链合成过程,cDNA,5,35引物,mRNA反转录酶3mRNA,35引物,53,cDNA第一链,3,5引物,cDNA第一链 碱 或RNaseH,第二链合成,剩下的cDNA单链的3末端可能形成一个弯回来 的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二 条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链,cDNA第一链,5DNA。,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链 cDNA第二链,53,用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA 中有用的序列被切掉）。,核酸酶S1,cDNA第一链 cD

5、NA第二链,53,cDNA第一链 cDNA第二链,53,35,cDNA合成,缺点：合成 效率低;1%mRNA能合 成cDNA。,改进RNase H酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎 片断。DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接 酶连成一整条DNA链。,cDNA,mRNA反转录酶,35引物,35引物,mRNA,35,DNA聚合酶mRNA,DNA,聚合酶mRNAcDNA第一链,mRNAcDNA第一链 RNaseH,cDNA第二链 cDNA第一链,3,DNA ligase,去引物,cDNA末端修饰,借助末端

6、转移酶给载体和双链cDNA的3端分别 加上几个C或G，成为粘性末端。在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。接上人工接头粘性末端,CCC,末端转移酶CCC,加 人 工 接 头,三、cDNA克隆载体如果用功能测定来筛选目的基因，可用质 粒载体来构建cDNA的表达文库。如果通过分子杂交或抗体筛选目的基因，可用噬菌体载体构建cDNA文库。噬菌体载体 Zap cDNA 载体,ZapcDNA 载体优点：1、高的转染效率2、可在体内用M13辅助噬菌体将其变为真核生物的 质粒表达载体。含有一个真核启动子,ZapcDNA 载体的噬菌 粒营救,第二节 cDNA文库的筛选表达分析核酸原位杂交1

7、、已知氨基酸序列的相关简并密码子探针；2、纯化蛋白质的相应抗体探针；3、差异表达的扣除cDNA探针。,一、简并寡核苷酸探针,简并探针：是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基 可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可 以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏 好,减少简并性。在探针库中，只有一种与目的基因完全互补。一般为17个核苷酸，序列相同，碱基组成不同。杂交时借助一定浓度氯化四甲铵控制解链温度（Tm）,操作过程,简并探针的假阳性由于探针库中只有一种是与目的基因完全 互补的，其它的探针有可能与不相关的片 断杂交，产生假阳性信号。1、制备“猜测体探针”2、PCR猜测体技术,解决方法：1）制备

8、“猜测体探针”一种人工合成的用于分离克隆基因的低简并性的 寡核苷酸探针，其核苷酸序列是根据特定物种当 中某种已知蛋白质的密码子使用频率，同时又采 纳了根据猜测最可能在目的基因中出现的密码子 资料，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区 段进行合成。较长的唯一的寡核苷酸序列，它能够大范围的却 不能够完全的同靶序列互补。,2）PCR猜测体技术,步骤：1、根据末端32个氨基酸序列，设计PCR简并引物；2、以cDNA为模板；对目的基因特异性扩增；3、产物连接到载体上克隆，用唯一猜测体探针杂 交，选择阳性克隆；4、分离的克隆中部为32氨基酸序列，两侧为引物序 列；5、用这段插入序列为探针，筛选噬菌体cDN

9、A文库。,根据末端32个氨基酸序列，设 计PCR简并引物，以cDNA为 模板，进行扩增,用猜测探针杂交筛选阳性克隆,PCR-猜测体探针,二、抗体探针,利用免疫学的原理，检 测克隆基因的表达产物。,抗体鉴别阳性克隆用专门设计的表达载体，将真核基因编码的蛋白 质在大肠杆菌中实现表达，通过免疫化学法进行 检测。,三、差示杂交需要两种不同的细胞群体（目的基因正常 表达、目的基因不表达），分别制备两种 不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针（或以相应的cDNA作探针）平行杂交，对 有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克 隆文库进行筛选。,差别杂交的局限性：杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为 明显。

10、工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间 的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一 致。,四、扣除杂交,原理：去除普遍共同存在的、或是非诱发产生的 cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到 有效的富集。羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA,操作：从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取 和分离总mRNA。将表达A蛋白的总mRNA合成cDNA第一链；作为探针 群同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA即为特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行 扩增、克隆、测序。,A组织,B组织

11、,总mRNA（A）含蛋白A的mRNA,总cDNA第一链内含蛋白A 的cDNA,杂交,羟磷灰石柱,吸收 RNA-DNA,羟磷灰石柱,总mRNA（B）不含蛋白A的mRNAB A过柱,AA A,PCR,cDNA文库,失突变的目的基因,第三节 cDNA表达文库的功能筛选,一、蛋白质活性分析1、真核的表达文库组成混合池，转染动物细胞，鉴 定目的基因的功能，筛选出目的基因的克隆重组体。2、功能性探针筛选噬菌体表达文库。3、定向克隆cDNA库，体外转录mRNA,再将其注导入 适当的寄主细胞，分析表达蛋白质功能。,二、酵母双杂交系统,又叫相互作用陷阱，有效的分离能与已知的靶蛋 白相互作用的蛋白质的编码基因。应

12、用范围：鉴定新的蛋白与蛋白相互作用；鉴定蛋白级联底物；鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响；在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质。,基本原理：,许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上 可以分开的、功能上相互独立的结构域组成；应用重组DNA技术，可以将来自同一个转录因子的、或者两种不同转录因子的结构域分开，分开的两 种结构域在体内重新组装成具有功能的转录因子，从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的 报告基因的表达。,例：酿酒酵母的半乳糖苷酶基因（lacZ）的转录激活因 子GAL4，在N端1147位氨基酸区段有一个DNA结 合域（DNA-BD）；在C端768881位氨基酸区段有 一个转录激活域（

13、AD），DNA-BD能识别上游激活 序列（USA）并与之结合；AD通过同转录机制中的 其它成份之间的结合作用启动USA下游基因进行转 录。用DNA重组技术将它们分开，即使在同一个寄主中 表达，它们不能激活lacZ基因进行转录。,组成元件用于筛选的报告基因lacZ（寄主基因组内）；pGBT9（DNA-BD载体）：插入了BD和 诱 饵基因；pGAD424（AD载体）：插入AD基因和待测的靶蛋白 基因。外源基因都按正确的取向和读码结构插入在载体 的MCS内，表达的靶蛋白和诱饵蛋白分别会同BD和 AD之间产生融合作用，形成杂种蛋白质。寄主菌株：剔除掉GAL4基因的酿酒酵母,交文库筛选策略,优点：快速获

14、得相互作用蛋白的基因；只需单一步骤的质粒构建；在体内鉴定蛋白的相互作用；弱小的，暂时的相互作用也能鉴定；能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号。,缺点：双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞 核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工 如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无 法进行。容易出现“假阳性”。通常由以下原因造成:prey蛋白的非特异性结合；无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录。,三、cDNA噬菌体展示,将编码特异蛋白的基因序列插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组 噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合 外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库

15、 中与外源蛋白质相互作用的蛋白质。,PIII,基因型,表达型,实验策略构建一个含靶蛋白的噬菌粒载体M13助噬菌体供体大肠杆菌（寄主细胞）,筛选方法被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结 构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合，此 叫“多肽文库”。将靶蛋白分子固定于固相上，与“肽库”经过一 定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后 洗脱与靶分子结合吸附的噬菌体，收集并感染宿 主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱。经过3轮5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分 子特异结合的噬菌体得到高度富集。,常用的免疫抗体,优点淘选的高效率使得在极低的存在水平下，可挑选 到高亲和力噬菌体；所挑选到的噬菌体可在微量存在