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1、指导教师: 职称:摘要：【目的】研究工程菌 BL21（DE3）/pET32a-istALDH产乙醛脱氢酶的纯化和酶学性质。【方法】工程菌经过 IPTG 诱导后产生乙醛脱氢酶，通过Ni-NTA 亲和层析纯化，得到纯度较高的酶蛋白，并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。【结果】酶最终被纯化了9倍，并达到电泳纯。经过SDS-PAGE 测得该酶的分子量约为57 kDa。以乙醛为底物，酶促反应的最适温度为40，最适pH值为，热稳定性和酸碱稳定性相对较差；金属离子K+、Li+、AL3+对酶均具有激活作用，而Ag+、Zn2+、Gu2+对酶促反应具有强烈的抑制作用，酶活性基本丧失，在化合物EDTA、DTT中活性

2、明显提高，SDS使酶完全丧失活性；反应的最适底物是乙醛和NAD+,乙醛和NAD+动力学常数Km值分别为L和L，最大反应速度Vmax分别为mg和mg。【结论】研究为重组乙醛脱氢酶纯酶的纯化、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数。关键词：乙醛脱氢酶；纯化；酶学性质Study on Purification and Characterization of Recombinant ALDHStudent majoring in National Life Science and Technique Talent Training Base? Jie XuTu

3、tor Zhaoxin LuAbstract：Objective To purify and characterize recombinant aldehyde dehydrogenase expressed in engineered strain E. Coli BL21（DE3）/pET32a-istALDH. Methods The aldehyde dehydrogenase gene was expressed in engineered strain after IPTG induction and the crude enzyme was obtained by sonicat

4、ion. We purified the recombinant aldehyde dehydrogenase by using metal chelate affinity chromatography on a Ni-NTA column. Then we characterized catalytic kinetic parameter of purified enzyme. Results The molecular weight of aldehyde dehydrogenase measured by SDS-PAGE was kDa. The enzyme had an opti

5、mum temperature at 40, and an optimum pH of . It was unstable with thermostability and pH stability. Metal ions K+、Li+ and AL3+ could active the enzyme activity, while Ag+、Zn2+ and Gu2+could strongly inhibit the enzyme activity. The compounds EDTA and DTT could active the enzyme apparently while SDS

6、 could greatly inhibit the enzyme. The optimal substrates were acetaldehyde and NAD+ with the kinetic constant Km of mmol/L and mmol/L, respectively and Vm of mg and mg, respectively.Conclusion These results may provide an important basis for industrial applications of the recombinant aldehyde dehyd

7、rogenase.Key words: aldehyde dehydrogenase; purification; characterization 引言目前与酒精中毒关系密切的许多候选基因中研究最多的就是参与乙醇代谢的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）和乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）1-2。前者使乙醇转化为乙醛，后者使乙醛进一步转化为乙酸，最终分解为二氧化碳和水【3】。乙醛脱氢酶属于氧化还原酶类，广泛存在于微生物、植物和动物体中【4】。在人体中，一般都存在前一种酶，而且数量基本相等，但缺少后一种酶的人就比较少，此酶突变后活性

8、缺失，导致乙醛在肝脏内大量累积，导致肝脏损伤及某些癌症疾病【5-6】，因此在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注。国内外对于乙醇脱氢酶的酶学性质、分离纯化等研究比较成熟，而对于ALDH的研究较少【7】，国内已有相关研究如乙醛脱氢酶基因在甜菜、菠菜和水稻中【8-10】的表达等等，目前，ALDH的提取一般是以动物为原料，主要是从动物的肝脏中提取，这制约了该酶的产量11-12，通过微生物发酵、分离纯化ALDH具有很大的市场前景，本课题通过从重组大肠杆菌中分离纯化得到ALDH，并对其进行酶学性质的测定,为乙醛脱氢酶的工业化应用奠定基础。乙醛脱氢酶分离纯化及其性质的研究对将来控制和减少酒精性肝病的预防和

9、健康教育工作有重要意义1材料与方法 材料菌株基因工程菌E. Coli BL21（DE3）/pET32a-istALDH由食品院酶工程实验室构建、保藏。培养基LB培养基（w/v）：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10， pH 。121高压灭菌20min。主要试剂IPTG（上海生工生物有限公司）；牛血清白蛋白（国药集团化学试剂有限公司）；凝血酶为标准品（中国药品生物制品检定所）；琼脂糖（电泳级）（中国医药（集团）上海化学试剂公司）；考马斯亮蓝G-250（美国Sigma公司）；酵母提取物、胰蛋白胨等（英国Oxoide公司）；乙醛、甲醛、丁醛、戊醛等醛类物质；EDTA、DTT、2-ME、SDS、PM

10、SF等化合物；其它试剂均为市售分析纯。 主要仪器手体式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）BC/BP-225SB海尔冰柜（海尔集团）OPIONpH计MODEL818PYX-DHS-50X65 隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）UV-1601紫外分光光度计（日本SHIMADZU公司）HYG-A全温摇瓶柜（太仓实验设备厂）Sartorious电子精密天平（北京赛多利斯天平有限公司）SW-CJ-IBU洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）Centrifuge 5804R冷冻离心机（德国eppendorf公司）BS-100A自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）BIO-RAD PAC1000微型

11、电泳仪（BIO-RAD 生命医学产品有限公司）凝胶成像系统Gel Doc2000 （BIO-RAD公司）12 方法 乙醛脱氢酶的表达和制备从保存于-70超低温冰箱的基因工程菌甘油菌中挑取少许菌液划线于LB平板（含氨苄青霉素100g/mL和%葡萄糖）,37培养12-14h，挑单菌落接入LB培养基（含氨苄青霉素100g/mL和%葡萄糖）于30、100rpm培养过夜（11h），然后以4%的接种量转接到100mL的LB培养基（含氨苄青霉素100g/mL和%葡萄糖），37、180rpm培养约至OD600为时，加入IPTG至终浓度为ml，15、180rpm培养15h诱导乙醛脱氢酶的表达。将100mL发酵液

12、于4、9000rpm离心10分钟收集菌体，重悬于50mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH ）中，冰水浴中超声5s，间歇10s，400W 破碎15min后，10,000rpm离心15min收集上清即得粗酶液。 乙醛脱氢酶的纯化用缓冲液（含50mmol/L PBS、L NaCl, pH 平衡床体积为2mL的Ni-NTA小柱，在粗酶液加入5mmol/L咪唑后上样，样品过三次，然后分别用10倍介质体积的浓度为50 、100、150、200、500mmol/L 咪唑洗脱，每2ml收集一管，测定酶活，收集洗脱液后经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定纯化蛋白。 乙醛脱氢酶活力测定酶活测

13、定体系（3mL）： mol/L Tris-HCl， 2mmol/L乙醛， mmol/L NAD+，10 mmol/L 2-巯基乙醇， mol/L KCl，待测酶液。用分光光度法，在25、340nm下测定NADH吸光度的变化。定义每分钟催化还原1mol NAD+所需要的酶量为一个酶活单位。 蛋白含量测定采用Bradford法【13】，以牛血清白蛋白为标准蛋白，测595nm处吸光值，计算蛋白质含量。 纯度鉴定和分子量测定采用垂直板SDS-PAGE电泳测定乙醛脱氢酶的纯度和分子量，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。 乙醛脱氢酶酶学性质 酶的最适反应pH及pH稳定性在不同pH的缓冲液（L Tris

14、-HCL缓冲液,；L磷酸钾缓冲液,pH ；L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH ）中测定酶活力，研究酶促反应的最适反应pH。将酶液分别置于不同pH的缓冲液中，30保温1 h，按常规酶活测定方法测定剩余酶活力，以未处理的酶活为100%，研究酶的酸碱稳定性。酶的最适反应温度及热稳定性在不同温度下测定酶活力，考察酶的最适反应温度。将酶液在不同温度水浴锅中保温2 h，每15min取样测量其对应的剩余酶活力，以未处理的酶活为100%，考察酶的热稳定性。 金属离子和其他化合物对酶活力的影响在不同反应体系中分别加入 mmol/L和 mmol/L的各种金属离子和化合物，测定酶活力，以未加入的酶液做对照，观察金属离子

15、和化合物对酶活力的影响。不同底物对酶活性的影响用不同底物取代原测定方法中的底物，测定酶的活力，考察酶的最适作用底物。以原测定方法中的底物测得的酶活力作为对照。动力学常数Km和最大反应速度Vmax的测定将酶液分别与不同浓度的乙醛和NAD+底物作用，测定酶反应的初速度，用Lineweaver-Burk 双倒数作图法求出以乙醛和NAD+为底物的Km值和Vmax值。2 结果与分析乙醛脱氢酶的分离纯化经过IPTG诱导表达后的粗酶液活力达到 U/mL，比活力达到 U/mg。粗酶液经过Ni-NTA亲和层析后，经SDS-PAGE检测，只显示单一条带，分子量约为57kD（图1），说明已达到了电泳纯，纯化倍数是粗酶液的9倍，回收率为%（表1）。表1 重组大肠杆菌乙醛脱氢酶的纯化Table 1 Purification of acetaldehyde dehydrogenase from E. Coli BL21（DE3）/pET32a-istALDHPurification stepActivit