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1、 间歇灭菌法煮沸消毒法三、实验材料每组同学需要准备以下材料（14人/组）： 小试管：21支（15*150mm） 培养皿：60套（9cm） 移液管：15支（1000ml）、1支（10l） 三角玻璃棒：2支 瓷缸：1个（1000ml） 三角瓶：3个（500ml）、1个（250ml）、2个（100ml） 量筒：1个（100ml） 玻棒：1支 分液漏斗：1套 药匙：2把 标签贴纸：1张 记号笔：四、实验步骤培养基的制备过程称量-溶解-调节pH值-过滤-分装及包扎-灭菌-灭菌后试管摆放斜面 1.称量按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。 配方： 牛肉膏 5 g 蛋白胨 10 g NaCl 5 g 蒸

2、馏水 1000 ml 琼脂 20 g （另称于三角瓶中） 2N NaOH配制： 1.量取80ml去离子水置于100-200ml塑料杯中。 2.称取8g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中，边加边搅拌。 3.待NaOH完全溶解后，用去离子水将溶液定容至于100ml。 4.将溶液转移至塑料容器中后，室温保存。 2.5N HCL配制： 1.在78.4ml的去离子水中加入21.6ml的浓盐酸，均匀混合。 2.室温保存。2.溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。3.调节pH值用玻璃棒沾

3、少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH。4.过滤用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。5.分装及包扎根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。6.无菌水的制备 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。250mL三角烧瓶（装有玻璃珠），分别装自来水90mL和100mL，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。7.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌30分钟。 操作过程 加水装锅盖盖加热当压力升为0.5kg/cm2时排放冷空气正式升压保压（1.1kg/cm2，121，保持20-30min）停止加热自然降压至零排放余汽开盖

4、取出灭菌物品趁热摆斜面检验灭菌效果。8. 灭菌后试管摆放斜面当培养基冷却至50左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。注 意 事 项1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2 ；5、分装过程中注意不要

5、将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。9.倒平板的方法将培养基加热融化，待冷却至5560 0C时，倒平板。每个培养皿中倒入1520ml，铺平，制成平板。倒好的平板在超净台里吹去冷凝水备用。10.周围环境中微生物的观察 在牛肉蛋白胨平板上作如下实验：用未洗过的手指头在平板是涂抹 用肥皂洗过的手指头（不用毛巾擦）在平板是涂抹（用力一致） 用旧纸币在培养基上拖动 放置一根头发 打开培养皿置实验台上（空气中）10min按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min对着培养皿上的培养基咳嗽稍稍打开嘴唇压在培养基上 以上用报纸包好倒置370C培养箱里培养48小时观察结果 本次实验的任务: 配制1

6、L牛肉膏蛋白胨液体培养基 200ml 600ml 200ml 试管斜面 固体 液体 200ml 50ml 3瓶 4瓶 准备2瓶无菌水（90ml和150ml各1瓶） 7支试管 五、实验结果及分析六、实验作业1.牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?3.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？4.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？5.从周围环境中微生物的观察，你认为无菌操作应注意什么?实验二 微生物的分离技术1、了解微生物分离和纯化

7、的原理 2、掌握几种常用的分离纯化接种培养的基本操作技术。3、练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。二、实验原理 在自然界中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的，为了生产和科学研究的需要，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。 为了获得纯种的微生物，一般根据该微生物营养或培养特点，或对某种抑制剂的耐受性不同，或对某种环境条件要求不同，从而制作或设置一些选择性培养基，或选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种

8、菌株。 样品： 土样10g 培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基平板26皿其它： 无菌水、试管、移液管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、接种环。（一）土壤稀释液的制备 称取土样10g，放入盛90ml无菌水三角瓶中，振荡1520分钟，使微生物细胞分散。将土壤悬浮液置于沸水中煮10 20分钟，静置冷却，即成10-1的土壤悬液。另取装有9ml无菌水的试管，编号为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7，用移液管吸取10-1土壤悬液1ml，加入编号10-2的无菌试管中，吹吸三次，使之混合均匀，即成10-2的土壤稀释液。再用另一个枪头吸取10-2试管中的土壤稀释液1ml ，

9、加入编号10-3的无菌试管中，轻轻摇动，使之混合均匀，即成10-3的土壤稀释液，一定要每次更换一个移液管（连续稀释）。同法依次分别稀释成10-6和10-7等一系列稀释度菌悬液 。（二）平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法平板涂抹法（涂布法） 每组取牛肉膏蛋白胨培养基平板12皿。 在无菌平板编上10-4、10-5、10-6 、10-7号码，每一号码设置三个重复，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 用移液管吸取相应的土壤稀释液0.1mL放在相应的平板上。 用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂抹均匀。 牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置于370C条件下培养，23d后，观察菌落形态

10、及计数菌落，并计算出每g土壤中微生物的数量。如果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，至最后得到纯培养为止。（三）平板划线分离法 每组每人取牛肉膏蛋白胨培养皿1付（共14皿），在皿底贴上标签，注明事项。 用接种环取相应的菌液一环（103）在平板上划线。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于37培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约600角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一

11、次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于37培养。（四）培养与移植 取倒置恒温箱中、培养23天的平板，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨培养基的斜面上，然后置于37恒温箱中培养，待菌落长出后，检查菌落是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其它杂菌混杂，就可再一次进行分离、纯化，直至获得纯培养。 用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角应小些，动作要轻巧，以防划破平板。 用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。 平板不能倒的太薄

12、，最好在使用前一天倒好。为防平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。（五）四大类微生物菌落形态的比较和识别 区分和识别各大类微生物通常包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面的观察。 菌落形态： 菌落表面湿润：细菌薄而小，酵母菌厚而大。菌落表面干燥：放线菌密而小，霉菌松而大。 细胞形态： 细菌小而分散 酵母菌大而分散 放线菌丝状细 霉菌丝状粗 请把分区划线的平板交到老师处，便于老师评价。1.试拟出从土壤中分离芽孢杆菌的主要实验步骤。2.在你所实验的培养基平板上长出的菌落属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。挑取细菌在试管斜面上保存？处理细菌放线菌酵母菌霉菌种类特征3划线分离

13、时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？4培养时为什么要将培养皿倒置培养？实验三 微生物数量的测定一、实验目的 学习平板菌落计数的基本原理和方法 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2-3或更多个细胞。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，使用菌落形成单位（colony-forming units, cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多