艾德KRAS试剂盒说明书样本.docx

1、艾德KRAS试剂盒说明书样本【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase ChainReaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常用致癌基因。该基因突变常用于各种恶性肿瘤，在肺癌患者中突变率为1530%，在结直肠癌患者中突变率为2050%。导致KRAS处在激活状态突变重要位于第12和13密码子上。KRAS基因突变普通会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗E

2、GFR抗体类药物产生耐药。但是，10月最新研究发现第13密码子上Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反映性（参见：De Roock. W. JAMA. ;304(16):1812-1820）。因而，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗针对性，减少治疗费用，节约宝贵治疗时间。大某些肿瘤突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因而所提取DNA常带有大量野生型DNA，因此对体细胞突变检测需要较高特异性，而当前广泛使用直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。本试剂盒用于检测人类KRAS基因12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为

3、检测样本，提供突变状态定性评估。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物大肠癌等癌症患者。该产品用于组织中提取DNAKRAS基因7种突变检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选取肿瘤靶向药物治疗提供参照。表1 人类KRAS基因12和13密码子上7种热点体细胞突变 突变名称 氨基酸变化 碱基变化 Cosmic ID 公司命名 Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸 GGTGAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸 GGTGCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸 GGTGTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸 GGTAGT 517 12-1-

4、A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸 GGTCGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸 GGTTGT 516 12-1-T Gly13Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGCGAC 53213-2-A【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中具有突变基因。运用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同步，运用双环探针对扩增产物进行检测，结合特别PCR反映程序和高特异Taq酶使用，在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变检测，以达到对稀有突变检测高特异性和高敏捷度，即高选取能力。【重要构成成分】试剂盒采用8联PCR管设计，每一种8

5、联PCR管检测一种样品，8联管1-7(或A-G，或8联PCR管两端各有一种小孔，小孔居侧端为1号管，小孔居中端为8号管)管内装有相应KRAS基因7种突变检测和内控试剂，突变由FAM信号批示，内控由HEX（或VIC）信号批示；8（或H）号管作为DNA提取质量外控检测管，亦由FAM信号批示，内控和外控作为对试剂、DNA质量以及操作自身质控，选取检测区域是人类KRAS基因相对保守区段，约100bp，这样即便DNA有降解，外控和内控依然可以最真实地反检测所用DNA质量非常重要。由于肿瘤复杂性，所采集临床样品应KRAS基因有效DNA量。每个PCR反映管内均具有510 pM特异性引往往会混有正常组织细胞，

6、不同类型样品正常细胞混杂限度不同，并且提取物、20 pM双环探针、12.5 M dNTPs、175 M氯化镁、1 mM硫酸铵、2.5 mMDNA纯度和质量也因样品类型而变化，特别是用福尔马林固定石蜡切片样氯化钾和纯化水等。（详见表2和表3）品，福尔马林会对DNA有交联和降解作用，因而请按下面推荐样品类型顺序表2 试剂盒构成收集样品并提取DNA用于检测，客户可依照临床实际样品状况进行选取。试剂盒规格 12测试 1. 推荐样品类型顺序：新鲜病变组织冰冻病理切片石蜡包埋病理组织或切8联PCR管反映条 12条 片。Taq酶（KRAS） 35 L 2. 推荐使用商业化试剂盒来提取人类基因组DNA。所提D

7、NA需用紫外分光KRAS阳性质控品250 L光度计测定浓度，其DNAOD260/OD280在1.82.0。提取完DNA建议立表3 8联PCR管反映条构成即进行检测，否则请于-20如下保存，保存时间不要超过6个月。 管号 检测试剂 体积 荧光信号 3. 从新鲜病变组织中取样应拟定至少具有30%肿瘤病变组织。1 A 12-2-A 35 L FAM，HEX/VIC 2 B 12-2-C 35 L FAM，HEX/VIC 4. 石蜡包埋病理组织或切片样品应拟定具有肿瘤病变细胞，所取某些尽量在3 C 12-2-T 35 L FAM，HEX/VIC 蜡块中部。4 或 D 12-1-A 35 L FAM，H

8、EX/VIC 5. 所用石蜡包埋病理组织或切片样品普通请选取保存尚未超过3年样品。5 E 12-1-C 35 L FAM，HEX/VIC 【检查办法】6 F 12-1-T 35 L FAM，HEX/VIC 建议在每次PCR反映中，每份样品和阳性质控品（STD）、阴性对照（NTC，7 G 13-2-A 35 L FAM，HEX/VIC自备纯化水）共同进行分析。8 H外控35 LFAM 1. 取出KRAS阳性质控品和Taq酶（KRAS），阳性质控品先解冻，再振荡混匀。其他需要自备试剂和耗材有：阳性质控品和Taq酶（KRAS）需迅速离心15秒待用。1. 石蜡切片样品DNA提取试剂推荐选用厦门艾德生物

9、公司核酸提取试剂2. 分别向体积均为45 L待测样品DNA、KRAS阳性质控品和纯化水（NTC）（型号：FFPE DNA，Cat NO. ADx-FF01）；组织和胸水可使用厦门艾德中加入2.25 L Taq酶（KRAS），涡旋器上混匀15秒，然后迅速离心15秒。 生物公司组织、胸水样品DNA分离试剂盒（Cat NO. ADx-TI01）。 （1） 依照样品来源不同，可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。2. 无DNase和RNase移液器滤芯吸嘴。 新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。 3. 无DNase和RNase纯化水。（2） 石蜡切片样品DNA浓度推荐为1.53 ng/

10、L，即每单个反映管添加【储存条件及有效期】DNA量为7.515 ng。依照石蜡切片样品保存年限不同，建议：须避光储藏在-205。有效期为10个月。开瓶后使用不影响产品有效保存不超过三个月石蜡切片样品每单个反映管添加DNA浓度期。使用完毕后于-205保存。为1.5 ng/L；保存年限三个月至一年石蜡切片样品每单个反映管试剂盒在运送过程中，需要泡沫箱加冰袋密封运送，运送时间不超过一周，添加DNA浓度为2 ng/L；保存年限一年至三年石蜡切片样品每运送温度不高于室温。单个反映管添加DNA浓度为2.53 ng/L；不推荐使用保存超过三【合用仪器】年石蜡切片样品。Stratagene Mx3000P?/

11、3005P?、ABI7900HT、ABI7500、ABI StepOnePlus、（3） 非石蜡切片样品DNA浓度推荐为0.41 ng/L，即每单个反映管添ABI7300、LightCycler480、Bio-Rad CFX96。加DNA量为25 ng。注意：（4） 稀释样品DNA时推荐使用TE（pH8.0）。稀释办法不推荐跨数量级 使用ABI仪器时探针模式设立，Reporter Dye：FAM、VIC；Quencher 稀释，即每次稀释倍数控制在10倍以内；稀释时取样量体积不适当小Dye：TAMRA；Passive Reference：NONE。于5L，以免稀释后终浓度与预算值有偏差。 在A

12、BI7900中，本试剂盒仅合用于ABI7900普通机型（非FAST机型），3. 在PCR管冰架上，轻轻揭开8联PCR管反映条条盖。如发现管盖内侧有液反映程序模式为原则模式，反映体积选取40 L，且需要PCR 8联反映条辅助点，开盖前请先离心。器（BIOplastics 公司，Cat：7900RAN）。4. 将混好DNA样品依次取5 L靠着PCR管上管壁加入8联PCR反映条中，然 合用于LightCycler480代仪器，若需在LightCycler480代仪器上使后小心盖上8联PCR管反映条管盖。用，则必要进行荧光校正。若LightCycler480代仪器也浮现荧光交叉现象，注意：加好样品PC

13、R反映条应及时上机实验；若因特殊因素不能及时上则也需要进行荧光校正，且需要PCR 8联反映条辅助器（BIOplastics 公司，机反映，应将PCR反映条置于冰水混合物上或4冰箱（温度恒定）保存，Cat：B-79480）。保存时间不适当超过12个小时。 在使用Stratagene Mx3000P?/3005P?仪器时若发现荧光净升信号5. 离心8联PCR管反映条。（dR）较低且本底荧光（R）非常高，应恰当减少仪器增益设立。6. 将8联PCR管反映条放入实时PCR仪器。PCR反映板布局见表4中推荐办法。 关于各仪器详细设立办法可从厦门艾德生物医药科技股份有限公司网站资料下载区获得。 PCR仪器在

14、使用过程中应至少每年校准一次。【样本规定】1 / 2表4 PCR仪96 孔板建议布局名 称 1 2 ?10 11 12 12-2-A 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 12-2-C 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 12-2-T 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 12-1-A 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 12-1-C 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 12-1-T 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 13-2-A 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 外控 样品1 样品2 ?样品10 STD NTC 7. 打开仪器窗口，按照

15、下图中阐明扩增程序图进行设立。 第一阶段：95 5分钟，1个循环；第二阶段：95 25秒，64 20秒，72 20秒，15个循环； 第三阶段：93 25秒，60 35秒，72 20秒，31个循环； 信号收集：第三阶段60时收集FAM和HEX（或VIC）信号，执行实 时PCR，保存文献。8. 实验结束后，使用2层PE手套包扎好PCR反映条（使用Mx3000P仪器时应当待热盖冷却后再解决，以免烫伤，同步可避免由于PCR管盖较热易开导致污染），并按生物垃圾解决。如非特殊需要，禁止打开PCR管盖，以防导致污染。1. 阴性对照(NTC)1-7（或A-G）号管FAM信号应无曲线升起。若7管其中任一管FAM信号升起，则本次实验成果无效，同步建议重做一次。若1-7（或A-G）号管HEX（或VIC）信号及8（或H）号管FAM信号偶尔升起，此属正常现象，不影响对突变检测成果判断。2. 阳性质控品(STD)Ct值普通不大于20，但也许会由于不同仪器不同阈值设立而发生波动。3. 拟定实验与否成功可信：（1）外控对照反映孔FAM信号应当升起。若为石蜡切片样品，则其Ct值应在1521之间；若为非石蜡切片样品，其Ct值应在1319之间。（2）若能满足1）规定，则继续进行分析。（3）如果其Ct值不大于（1）规定范畴，阐明加入DNA过量，应减少DNA加入量再进行实验。但突变信号无升起或者落在阴性区，该实验成