基因转移PPT课件下载推荐.ppt

1、当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及重组。,9,图 转导作用,10,体外包装 in vitro packaging定义：将重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,（3）体外包装的噬菌体的转导,11,体外包装的方法与过程,12,转导,通过受体大肠杆菌细胞表面的DNA接受器位点（receptor site），将带有外源基因的重组体注入受体菌进行扩增。,13,4.转染 transfection,将外源DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞。方法：CaCl2法处理宿主菌成感受态，重组噬菌体DNA进入感

2、受态细菌，进行复制和繁殖。采用人工脂质体包裹病毒DNA，再与受体细胞膜融合，而将DNA导入宿主细胞。病毒的感染与转染相区别！,14,二、基因转移的目的,为什么要将重组体导入受体细胞？1.大量扩增重组DNA重组DNA量少，只有导入受体细胞，经多次细胞分裂，可大量扩增重组体。2.防止DNA降解获得的重组DNA，必须立即导入宿主细胞，否则非常容易降解。3.纯化和筛选重组DNA区分重组体和非重组体。被转化的宿主中，含有多种形式DNA，必须筛选真正重组体。,15,第二节 受体/宿主细胞,一、种类细菌 E.coli酵母高等动物细胞植物细胞,16,二、受体细胞必须符合的条件,.对重组DNA的复制和扩增没有严

3、格的限制.不存在特异的内切酶体系，降解外源DNA；.在重组DNA增殖过程中，不会被修饰；.重组缺陷型，不会产生体内重组；.容易导入重组DNA；.符合重组DNA操作的安全标准。,17,三、E.coli受体细胞,1.特性 用于转化的E.coli 细胞的特点（1）限制修饰系统缺陷的突变体，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株（R，M），（2）允许外源DNA 进入E.coli体内，并稳定地遗传给后代。,18,2.受体菌的条件与选择符合生物安全性的要求。宿主菌的限制酶和重组酶应为缺陷型。宿主菌处于感受态。转化率。3.常用E.coli菌株DH5、DH10BJM101JM109其它,19,图 常用 E.co

4、li 菌株,20,21,第三节 重组体导入原核细胞,一、一般概念1.转化 transformation将重组DNA或外源基因导入宿主细胞（菌株）的过程。2.转化子 Transformant将经过转化后的细胞，在选择培养基中培养，筛选出的带有重组DNA 的受体细胞（菌株）。,22,3.转化率,（1）定义每 g DNA可转化的受体细胞（细菌克隆）数。（2）计算转化细胞数/gDNA。如1 ng pBR322产生104个转化子，吸收的DNA分子只占总DNA的0.1%，转化效率不高。,23,（3）转化率的计算,统计每个培养皿中的菌落数。转化子：即转化后在含抗生素的平板上长出的菌落。根据此培养皿中的菌落数

5、，可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积转化频率 转化子数每mg 质粒DNA 或转化子总数加入质粒DNA 量mg,24,感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数,25,转化大肠杆菌的方法有2类：1.感受态细胞法将宿主细胞制备成感受态，这种细胞容易接受外源DNA。2.电击法（电转化法）利用电击的方法，在宿主细胞上瞬间打“洞”，让外源DNA进入细胞内。,二、转化的方法,26,（一）基本概念由于质粒载体缺失了mob 基因，不能自行接合转移，必须改变E.coli 质膜的通透性。1.感受态*

6、Compenent受体细胞经过诱导，产生一种短暂的吸收外源DNA的生理状态。2.感受态细胞 Compenent cells经物理和化学方法处理，受体细胞膜的通透性改变，允许外源DNA 进入。,三 感受态细胞的制备,27,3.感受态假说,cacl2溶液制备感受态细胞的机制假说1细菌的细胞壁局部溶解，质膜穿孔，让外源DNA进入。假说2细胞处于感受态时，表面形成一种可接受DNA的酶位点，一旦细胞制备成感受态细胞，就能稳定地摄取外源DNA分子。,28,1.CaCl2的作用改变细菌质膜通透性，允许DNA进入。2.操作程序 挑单菌落置培养基中。过夜培养，至OD600=0.3 0.5。冰浴10 min。4离

7、心，去培养液。冰冷的0.1molCaCl2 悬浮菌体。冰冷的0.1molCaCl2 重悬浮菌体。分装，-70 冻存。,（二）CaCl2制备感受态大肠杆菌,29,3.CaCl2法的优点,方法简便，使用广泛。转化效率高，106108/gDNA。可满足一般实验的要求。制备的感受态E.coli，可于-70保存半年（无菌甘油占总体积的15）。,30,图 制备感受态E.coli的过程,*,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,On ice 10 min,4离心收集菌,用冰冷的CaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装，-70 冻存,用冰冷的CaCl2重悬,On ice 30 min,冰冷CaCl

8、2重悬,31,（三）转化：热休克法 heat shock,1.转化方法与过程感受态细菌加入重组质粒，置冰浴中混匀。42，热休克。细菌摄入重组质粒。加入LB培养基，37培养。转化液接种到含抗菌素的平板倒置培养，37过夜。,32,图 热休克法 heat shock,10ng重组DNA,100L感受态菌,冰上混合。静置10分钟,42C 1分钟,加入1mL LB培养基,37震摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,33,图 细菌的平板培养,34,（四）影响转化率的因素,1.重组质粒的质量和浓度用于转化的重组质粒应是cccDNA。1ng 的cccDNA 可使50l 的感受

9、态细胞达到饱和。转化效率与DNA 浓度在一定范围内成正比。DNA 过多，转化效率降低。DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。,35,2.感受态细胞的生长状态和密度,生长状态细菌生长密度达到对数生长期为好。密度过高或不足均会影响转化效率。DH5菌的OD600=0.5 时，细胞密度在5107 株/ml菌液时，较合适。,36,2.感受态细胞的生长状态和密度,CaCl2处理要充分 使细菌细胞膜失去一些蛋白。感受态菌要储存在-70以下。感受态菌融化必须迅速。融化后的感受态菌不能再次冻存使用。多次转接的菌不可用。,37,3.试剂的质量要高,所用的试剂纯度高，用AR或GR。用超纯水配制。使用试剂分装

10、保存。,38,4.无菌操作，防止污染,在转化过程中，防止DNA 酶、杂菌和杂DNA的污染，否则实验失败。在无菌条件下操作。所用新的离心管、tip头等，并经高压灭菌。所用试剂要灭菌。,39,第四节 外源基因导入酵母细胞,一、酵母菌株的选择转化率高的酵母菌。突变酵母菌株（与导入的载体基因互补）。不育的酵母菌株（不会与其他酵母接合）。常用的酵母菌：ura3-52、trp1-289、leu2、leu3、his3等。,40,酵母的克隆和表达载体有4种类型：YIP（整合型质粒）YRP（复制型质粒）YEP（附加体质粒）YCP（着丝点质粒）。其中，YEP附加体类质粒，含有2um质粒，是构建酵母表达质粒载体中最

11、常用的。,二、酵母细胞的载体,41,三、LiCl 转化法,1.LiCl利用Li+盐，使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。2.PEG（聚乙二醇）利用PEG，使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。3.转化的过程下图。,42,酵母,0.1mol/L LiCl处理,插入外源DNA的酵母载体,感受态,40%PEG 4000,43,四、原生质体转化法,原生质*：去除细胞壁后的酵母结构。PEG（聚乙二醇）：使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2：使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。,44,图 原生质体转化法,酵母菌,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2 PEG,插入外源DNA 的酵母载体,转化,45,

12、第五节 外源基因导入动物细胞,一、转染 transfection1.定义*动物基因的转移感染作用，将DNA或RNA转送进入活体细胞中。,46,2.转染的技术或方法,常用的转染方法有6种。（1）磷酸钙（calcium phosphate）主要机制：DNA附着到动物细胞之表面，然后吞噬。（2）二乙氨乙基-葡聚糖（DEAE-dextran）主要机制：（3）脂质体（liposome）主要机制：DNA带负电之磷酸根会与脂小体表面之正电荷结合，脂小体带正电荷的部分又会与细胞表面带负电荷的唾液酸结合，藉以进行转染。,47,（4）电穿孔（electroporation）主要机制：电流方式进行。（5）显微注射（

13、microinjection）主要机制：在下显微镜，以微细针管穿刺细胞将DNA射入。（6）病毒感染（retrovirus infection）主要机制：利用多种不同的病毒特性，将DNA改造成病毒的一部份，另外病毒本身有害基因也加以改造，再藉病毒感染方式送入基因。,48,二、磷酸钙共沉淀法,形成含磷酸钙和DNA的沉淀。程序：将DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀。DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内。细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞。再继续培养筛选转化株。该法不需要载体。不同细胞吸收DNA沉淀的能力不同。最多10%。,49,图 磷酸钙沉淀法,50,三、二乙氨

14、乙基-葡聚糖法,二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖（dextran）能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。,51,DEAE-dextran,细胞,外源DNA,预处理,摄入,DEAE-dextran,外源DNA,细胞,混合,摄入,52,四、脂质体法 lipofectin,脂质体：人工合成的磷脂。定义：将外源DNA用人工磷脂包埋，导入淋巴细胞和HeLa细胞。将待转化的DNA与人工磷脂混合，在表面活性剂的存在下，磷脂形成包埋水相DNA的脂质体结构。将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融合，DNA随即进入胞质和核内。,53,图 脂质体法 lipofectin,54,五、电穿孔法 electroporation,又称电击法、电转化法。方法电击仪。将目的DNA溶解在受体细胞悬浮液中，加入样品槽内，两端施加高压脉冲压电场，击破细胞膜产生小孔缝隙，使DNA直接进入受体细胞。该法不经过胞饮作用直接进入。,55,主要影响因素,最高转化率可达109-1010转化子/g DNA。电场强度。脉冲电压：电压太小，转化效率