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1、同时，Merrifield在20世纪60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124个氨基酸）。随后的多肽化学研究主要集中在固相合成树脂，多肽缩合试剂，氨基酸保护基的研究。1972，Lou Carpino 首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，到了20世纪80年代取代了叔丁氧羰基（BOC），成为了固相多肽合成中的首选合成方法。该方法中氨基酸的侧链大多基于叔丁基（But），因此，也称为FMOC-But策略。同时，在多肽合成树脂，缩合试剂以及氨基酸保护，包括合成

2、环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。进入21世纪，随着蛋白质组学的研究深入，对于多肽化学的要求不仅仅是合成方法，而更多的集中在多肽标记与修饰方法，以及蛋白结构与功能模拟多肽的合成以及长肽或蛋白合成。多肽化学合成的基本介绍 ?两种Z多肽化学合成方法，包括液相和固相两种方法。液相合成方法现在主要采用BOC和保护方法，现在主要应用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催产素等，其相对与固相合成，液相合成合成规模容易放大的许多优点。与固相合成比较，具有保护基选择多，成本低廉，个氨基酸以内的多肽合成，还有合成中需要对10主要缺点是，合成范围小，一般都集中在两种方法，BOC固相合成方法现在主要采用FMOC和

3、中间体进行提纯，时间长，工作量大。个氨基酸左右多30它具有合成方便，迅速，容易实现自动化，而且可以比较容易的合成到 肽。 氨基酸保护基1.1，），IleLeu，Gly，Val，20种常见氨基酸，根据侧链可以分为几类：脂肪族氨基酸（Ala），GlnGluAsp，Asn芳香族氨基酸（Phe，Tyr，Trp，His），酰胺或羧基侧链氨基酸（），亚氨，Thr，Met），含醇氨基酸（Ser碱性侧链氨基酸（Lys，Arg），含硫氨基酸（Cys直接决定了合成能够成功的关键。多肽化学合成中氨基酸的保护非常关键，（Pro）型基酸中氨基酸中有很多都是带有活性侧链的，需要进行保护，一般要求，这些保因为常见的20合成

4、中需要进行保护无副反应，合成结束后可以完全定量的脱除。护基在合成过程中稳定，。需要进TyrTrp，Ser，Thr，ArgHis，Asp，Glu，Lys，Asn，Gln，的氨基酸包括：Cys也可以Trp行保护的基团：羟基，羧基，巯基，氨基，酰胺基，胍基，吲哚，咪唑等。其中不保护，因为吲哚性质比较稳定。当然在特殊的情况下，有些氨基酸也可以不保护，象， Tyr。Gln ，Thr，Asn 3种氨基脱除条件表1 常H2/Pd-HBr/TFAPiperidine/DMFTFBoFmo 图1 常见3种氨基保护基结构 氨基酸侧链保护基团非常多，同一个侧链有多种不同的保护基，可以在不同的条件下选择性. 而且侧链

5、保护基和选择的合成方法这点在环肽以及多肽修饰上具有很重要的意义。的脱除，从某种意义上看，FMOC策略也不一样，有密切的关系，液相和固相不一样，固相中BOC和固关于侧链保护基的使用，请参考王德心的多肽化学就是氨基酸保护基的灵活运用与搭配。的几种保护AspCys相有机合成原理及应用指南第四章，我们这里主要介绍，Lys，这三个保护基可以完成多MobCys最常见的保护基有三种，Trt，Acm，基及其脱除方法。，这对于固相Trt，Dde，AllylLys对二硫键多肽的合成。最常见的保护基有：Boc，Fmoc，OAllOMe，合成环肽提供了很多正交的保护策略。Asp最常见的保护基有：OtbuOBzl， ，

6、同样也提供了多种正交的保护策略。OFm 2 巯基常见保护基表 结构 脱除条件 简称，I2/MeOH ，TFATrt HCl/HOAc Acm I2/MeOH，Hg2+ Mob HF，TFMSA，Hg2+ 表3 氨基常见保护基结脱除条简TFTrtHOAHCOOH TFA/DCM HCl/HOAcBoc ， NaOH/MeOH Pip/DMF，Fmoc H2NNH2/DMF Dde /THF ，吗啉Ph3P）4Allyl Pd（ 羧基常见保护基表3 脱除条件结构 简称HCOOH ，HOAcOtbu TFA， TFMSA ，HFH2/PdOBzl NaOH/MeOH OMe 4），吗啉Ph3PPdO

7、All （ DBU/DMF Pip/DMFOFm ， . 1.2多肽缩合试剂 目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法来完成接肽反应，最早使用的是将氨基酸活化为酰氯，叠氮，对称酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反应试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被后来的缩合试剂取代，按照其结构可以分为两种：缩合试剂主要有：碳二亚胺型，鎓盐型（Uronium）。1.2.1碳二亚胺型 主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC进行反应，由于反应中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，产生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其价格便宜，在液相合成中，可以通过过滤除去，应用仍

8、然相当广泛。EDC.HCl因为其水溶解性的特点，在多肽与蛋白的连接中使用比较多，而且也相当成功。但是该类型的缩合试剂的一个最大的缺点，就是如果单独使用，会有比较多的副反应，但是研究表明如果在活化过程中添加HOBt，HOAt等试剂，可以将其副反应控制在很低的范围。其反应机理如下： DIC活化反应机理图2 鎓盐型1.2.2，HATU，速度快，鎓盐型缩合试剂反应活性高，现在使用非常广泛，主要包括：HBTUTBTU甲基吗啉），DIEAN-等。该试剂使用过程中需要添加有机碱，如，二异丙基乙胺（PyBOP NMM（），该试剂加入后，才能活化氨基酸。 TBTU3 活化反应机理图 1.3多肽合成方法比较 ）s

9、olution phase synthesis1.3.1液相多肽合成（合成成本低在合成短肽和多肽片段上具有合成规模大，液相多肽合成现在仍然广泛的使用，象一些催化氢可以选择的反应条件更加丰富，的显著优点，而且由于是在均相中进行反应，化，碱性水解等条件，都可以使用，这在固相中，使用却由于反应效率低，以及副反应等原 两种反应策略。BOC因，无法应用。液相多肽合成中主要采用和Z Glu-Trp 图4液相合成. 1.3.2固相多肽合成 FMOC固相合成图5 需方法合成过程中，FMOC和两种。BOC固相多肽合成现在使用的主要有两种策略：BOC必须使用专HF，由于BOCTFA脱，而且在最后从树脂上切割下来需

10、要使用HF要反复使用使而且切割过程中容易产生副反应，因此现在使用受到实验条件限制，门的仪器进行操作，方法反应条件温和，在一般的实验条件下就可以进行合成，因此，用也逐渐减少。FMOC 也得到了非常广泛的应用。 固相合成中常用树脂1.3.2.1之，交联度在1-2%150m固相合成中树脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-中具有很好的溶胀性，DMFDCM，因为这种交联度下，树脂在间，现在使用的大多是1%树脂中最关键的部立体上是一个空间网状结构，能，反应物分子可以在树脂内部自由移动。分是连接手臂，它一端连接在树脂上，一端作为反应位点。目前广泛使用的树脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl

11、-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因为其对酸非常稳定，需要在HF，TFMSA等强酸条件下才能够切割下来。 6 固相合成常用树脂图 1.3.2.2茚三酮检测Kaiser固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为 ）。ser，His方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro， 试剂包括：Kaiser 茚三酮的乙醇溶液，6% A 80% 苯酚的乙醇溶液B， 2% 0.001M KCN的吡啶溶液C，AB检测过程，配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。取少量树脂，加入，如果溶液有兰色，或树脂

12、出现兰色，红褐色，表明还有下加热1001-2min滴，各C2-3 游离氨基，否则说明连接完全。 还有其它检测游离氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬兰法等。 茚三酮检测原理图7 固相合成切割方法1.3.2.3然后经过冰乙醚沉必须选择合适的切割试剂将多肽从树脂上切割下来，固相合成完成之后，由于选择的树脂不同，冷冻干燥得到最后产品。HPLC分离纯化，淀，离心收集沉淀，经过一般都是选择酸性条件下切选择的切割方法也不完全相同，氨基酸序列不同，在切割时候，切割，切割过程中需要添加对甲苯酚，树脂，一般采用HF割的条件，对于PAM，MBHA切割，树脂，一般采用TFARink-Amide，Trt对巯基苯酚，苯甲醚等试剂。而对于Wang，切割过程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三异丙基硅烷，苯酚等。这些添加试剂主要作减少这些碳正离子目的是俘获切割反应过程中生成的碳正离子，为碳正离子俘获试剂使用，。切割Tyr对部分氨基酸侧链的进攻导致的副反应，比较容易产生副反应的氨基酸有：Trp，），90/5/5HF/p-cresol/p-thiocresol（试剂用量一般10-15ml/g树脂。常用的切割配比： 2h-4h。TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反应一般是在室温条件下 多肽合成中主要问题1.3