黄曲霉毒素检测方法研究进展_精品文档Word下载.doc

1、1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物,它的毒性极强，对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时可导致肝癌甚至死亡。近年来,AFB1污染事件的发生,已引起世界各国及消费者对食品安全的关注1-3。世界各国对黄曲霉毒素的检出标准都做了严格的规定。1995年,世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15ug/kg. 因此,对AFT的检测不仅关系到动物的安全,更直接影响到人们的身体健康和生命安全,以下对AFT的危害及检测方法作一综述。1黄曲霉毒素的理化性质及其危害1.1黄曲霉毒素的理化性质黄曲霉毒素（Aflatoxins）是一组化学结构类似的化合物,目前已分离鉴定出

2、12种包B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇。黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素,B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物。即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。前者为基本毒性结构,后者与致癌有关。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子型式含 B1,B2,G1,G2 ,M1,M2等.其中M1和M2 主要存在于牛奶中4-5。B1为毒性及致癌性最强的物质。AFT在紫外线下发特定的荧光,根据荧光颜色不同,将其分为蓝紫色荧光的B族和黄绿色荧光的G族两大类及其衍生物。在紫外线下,黄曲霉毒素B1、B2发蓝色荧光,黄曲霉毒素G1、G

3、2发绿色荧光。黄曲霉毒素的相对分子量为312346,在水中的溶解范围为1020 mg/L,易溶于油,可大量溶解于氯仿、甲醇、乙腈、二甲基亚砜等中等极性的有机溶剂中,但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中较稳定,但在强酸性溶液中稍有分解,在pH910的碱性溶液中分解迅速, 同时易被强氧化剂分解。其纯品为无色结晶,耐高温,黄曲霉毒素B1的分解温度为268,紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。在自然条件下,食品中AFT稳定性很强。被AFB1污染的稻谷,室温下自然存放可长达20多a6。1.2黄曲霉毒素的危害黄曲霉毒素对人类健康的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物,途径有二,其一是

4、由受黄曲霉毒素（主要为B1）污染的植物性食物摄入,其二是经饲料而进入奶或乳制品（包括乳酪、奶粉等）的黄曲霉毒素（主要为M1）。黄曲霉毒素B1的半数致死量为0.36 mg/kg体重,属特剧毒的毒物范围（动物半数致死量10 mg/kg,它的毒性比氰化钾大10倍,比砒霜大68倍）,它引起人的中毒主要是损害肝脏,发生肝炎、肝硬化、肝坏死等。临床表现有胃部不适,食欲减退,恶心,呕吐,腹胀及肝区触痛等;严重者出现水肿,昏迷,以致抽搐而死。黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质,其致癌力是奶油黄的900倍,比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍,比3,4-苯并芘大4000倍,它主要诱使动物发生肝癌,也能诱发胃癌

5、、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症。亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明:食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变（Liver Cell Cancer,LCC）呈正相关性,长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因。中国医科院肿瘤医院明利华教授课题组首次确定了黄曲霉毒素使乙肝患者患肝癌的累积暴露剂量为0.130.49mg/kg体重,这仅为在实验条件下,给无乙肝感染的恒河猴喂食黄曲霉素使之致肝癌所需累积剂量的1/700,确立黄曲霉素是常见肿瘤肝细胞癌的重要的辅助病因。1988年国际肿瘤研究机构（International Agency for Research

6、 on Cancer,IARC）将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物。除此以外,黄曲霉毒素与其他致病因素（如肝炎病毒）等对人类疾病的诱发具有叠加效应4,7-8。黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关,黄曲霉毒素分子中的双呋喃环结构是产生毒性的重要结构,研究表明黄曲霉毒素的细胞毒作用可干扰信息RNA和DNA的合成,进而干扰细胞蛋白质的合成,导致动物全身性损害。2.黄曲霉毒素的检测方法黄曲霉毒素的分析方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的

7、检测分析提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。2.1薄层色谱法（TLC）TLC法是测定黄曲霉毒素的经典方法,是我国测定食品及饲料中AFTB1的标准方法之一（GB/T5009.231996）9。其原理是样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层板展开分离后,在365nm紫外灯下,AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。TLC有单向展开法和双向展开法,其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质,提高灵敏度。TLC法由于设备简单,易于普及,所以国内外仍在使用,但由于该法样品前处理繁琐,且提取和净化效果不够理想,提

8、取液中杂质较多,因而在展开时影响斑点的荧光强度,双向展开法虽避免了杂质干扰,但增加了操作步骤和时间。TLC法较适合于对黄曲霉毒素的定性检测,是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。该检测方法所用设备简单、费用低廉、容易掌握,适用大量样品的分离、筛选,一般的实验室均可开展,属于定性和半定量检测。TLC有单向展开和双向展开法,其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质,提高灵敏度,省略了柱层析等净操作步骤。TLC法由于设备简单,一般实验室都能满足,利于普及,仍是现在检测AFT的主要方法之一。Stroka10开发出的光度检测器在检测AFT时,最低限可以检测到1ng。Otta等在TLC上结合光度计,不仅能把

9、样品提纯,而且也能同时1次对多个样品进行检测11。江湖等利用HPTLC检测农产品中的AFT,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检出限达0.8、0.4、0.7、0.4g/kg12。王宏亮对国际（3B/T500922-1996）所规定的方法进行了部分改进，在利用CCl4抽提前，加人质量分数25%的醋酸铅溶液和质量分数4%的NaCl溶液，再用CCl4振动抽提，于薄层板点样后展开时，先用CCl4丙酮的混合液正向展开，然后用无水乙醚进行反向展开，回收率为76.9%，最低检出限量为5l0-9，改进后的方法进一步排除了蛋白质杂质，使提取与净化效果增强，在薄层双向展开时组分分离也更安全，AFTB1形成的

10、斑点易观察，操作简便，但增加了操作步骤13。2.2高效液相色譜法（HPLC）HPLC是近几年发展起来的检测AFTB1方法,主要是用荧光检测器检测,在适宜的流动相条件下,采用反相C18柱,使多种黄曲霉毒素同时分离。高效液相色谱法灵敏、分辨率高,可作定性、定量分析,同时可检测多个黄曲霉毒素种类,适于大批量样品的分析。宋欢采用佛罗里硅土净化柱净化，三氟乙酸柱前衍生检测饲料中AFTB1，回收率为83%，相关系数r=0.999814。李佐卿等则将免疫学技术和HPLC法相结合,采用免疫亲和柱对样品进行净化,AFTB1回收率达到97.3%,相关系数r=0.9994,最低检出限为6.25 pg,该法将提取、净

11、化、浓缩一次完成,大大简化了前处理过程,提高了工作效率及方法的灵敏度,但增加了成本15。文镜采用国产硅镁吸附柱层析分离纯化玉米中AFTB1,用HPLC法检测,方法简便,纯化效果好,最低检出量为0.08 ng,回收率为92.87%,该法制柱方便,而且降低了成本16。高效液相色谱法仪器设备昂贵,技术水平要求高,每次实验所使用的化学药剂和处理途径对试验结果影响程度差别很大,对实验结果的精度造成影响；样品还需进行繁琐的纯化处理,不适合快速检测。2.3微柱法微柱筛选法是将样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管,杂质被氧化铝吸附,黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附,在365 nm紫外线下呈蓝紫色荧光,

12、其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比,由于微柱不能分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,故检测结果为黄曲霉毒素的总量。微柱筛选法测定黄曲霉毒素,主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品。要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验,则需要对不同黄曲霉毒素组分进行分离,再利用其它方法检测。因此,微柱筛选法并不能完成整个黄曲霉毒素的检测过程,仅适用于定性检验。陈达民通过微柱法测定黄曲霉毒素,样品经前处理后，即在365nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量17。2.

13、4免疫化学法免疫化学法是根据免疫学抗原抗体高特异性结合,设计并发展起来的免疫学检测技术18。具有重现性好、灵敏度高、选择性强、特异性强、时间短、检测限低等特点,同时又能减少有害试剂的使用,对检测人员健康起一定保护作用,在AFT检测方面取得了很大的应用。具有代表性的主要有免疫层析法（IICA）、放射免疫分析方法（RIA）和酶联免疫法（ELISA）等,它们均可以进行定量测定。2.4.1免疫亲和柱荧光光度法（IAC）IAC是美国公职化学家协会（AOAC）检测AFT的标准方法。其原理是利用单克隆免疫亲和柱为分离手段,将单克隆抗体与载体蛋白成功偶联,偶联物填柱形成IAC,并与AFT半抗原产生对应的特异性

14、吸附关系。当样品通过柱子时,因抗原只能吸附相应的抗体,所以IAC也就只能吸附AFT,别的杂质因不被吸附而流出柱子。IAC的优点是在检测过程中,检测人员不用直接接触AFT,并接触很少试剂就完成整个检测。操作简单、耗时短、灵敏度高且能直接读数,所以应用范围很广。局限性是不能单独测AFB1、AFB2、AFG1和AFG2,只能测AFT总量,同时对试剂要求也较高,如检测过程中所有用到的水必须是双蒸水,而所用的容器也必须用双蒸水洗涤19。2.4.2免疫亲和柱净化荧光光度法（SFB）SFB是新发展起来的一种检测AFT的方法,其设备轻便、自动化高、操作简单、检测灵敏、时间短,广泛应用于检测日常饲料中的AFT是

15、否超标。国外Vicam公司开发出的V2系列型荧光光度计,可以直接读取AFT的总量。但用SFB法检测中药材中AFT的含量时,结果中出现很多假阳性,造成结果不准确。王晶等用SFB法快速检测日常食用酱油和醋样品中AFT含量,其检出限分别是25g/kg和1g/kg,添加回收率在85%以上20。2.4.3酶联吸附法（ELISA）ELISA是利用免疫、酶和生化技术来检测AFT。ELISA是上世纪70年代出现的新的免疫技术21,最初由荷兰学者an Weeman和瑞典学者Engvall与Perlman几乎同时提出,主要用于病毒的检测,70年代中后期开始用于真菌毒素的检测。ELISA以其简便、快速、灵敏、成本低、检测谱广等特点在检测方面越来越受到人们的青睐,是一种定性或半定量的方法22。ELISA的基本原理是首先将抗原或抗体固化。吸附在固相载体表面的抗原或抗体,仍然保持着其免疫学活性。其次是酶标记,被固定的抗原或抗体以共价键与酶连接形成酶结合物,而此物仍保持着免疫学和酶学活性。三是显色反应,酶标记物与相应的