绿色荧光蛋白和PCR关键技术Word文件下载.docx

1、GFP性质 GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便及时得到恢复。而某些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白荧光敏捷度远比荧光素标记荧光抗体高，抗光漂白能力强,因而更合用于定量测定与分析。但由于GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因而GFP敏捷度也许低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧

2、光是生物细胞自主功能，荧光产生不需要任何外源反映底物，因而GFP作为一种广泛应用活体报告蛋白，其作用是任何其他酶类报告蛋白无法比拟。GFP在肿瘤发病机制研究中应用GFP是一种分子量较小蛋白，易与其她某些目基因形成融合蛋白且不影响自身目基因产物空间构象和功能。GFP 与目基因融合，将目基因标记为绿色，即可定量分析目基因表达水平，显示其在肿瘤细胞内表达位置和量变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中作用及其分子机制提供便利条件。在肿瘤形成过程中，增殖和凋亡是一对互相矛盾统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处在休眠状态或自行消灭。肿瘤细胞凋亡受凋亡有关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡有关基因，

3、并与正常组织进行比较，则大体可判断此基由于抑制肿瘤细胞凋亡基因；反之，为增进肿瘤细胞凋亡基因。肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程体现，其主线因素在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。运用GFP 示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润关系，即可揭示肿瘤细胞浸润某些机制。发现过程1994年，华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP，有多项发现。世界上用大多数是钱永健实验室改造后变种，有荧光更强，有黄色、蓝色，有可激活、可变色。到某些不惯用做研究模式生物体内找有颜色蛋白成为某些人兴趣，现象正如当年在嗜热生物中找到后来应用广泛PCR用多聚

4、酶后一波浪潮。但是真发既有用东西并不诸多。成功例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其她荧光蛋白，涉及红色荧光蛋白。生物发光现象，下村修和约翰森此前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反映如氧化，后来产生荧光。而蛋白质自身发光，无需底物，来源是下村修和约翰森研究。下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事有关是学名为Aequorea victoria水母。1962年，下村修和约翰森等在细胞和比较生理学杂志上报道，她们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发

5、光蛋白时，有天下班要回家了，她把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，成果见水池闪闪发光。由于水池也接受养鱼缸水，她怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久她就拟定钙离子增强水母素发光。1963年，她们在科学杂志报道钙和水母素发光关系。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙新办法。钙离子是生物体内重要信号分子，水母素成为第一种有空间辨别能力钙检测办法，是当前仍用办法之一。1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨

6、丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后她们仔细研究了其发光特性。1974年，她们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、后来称绿色荧光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中懂得荧光共振能量转移（FRET）在生物中发现。下村修本人对GFP应用前景不感兴趣，也没故意识到应用重要性。她离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后，同事普腊石（Douglas Prasher）非常感兴趣创造生物示踪分子。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立依照蛋白质顺序拿到了水母素基因

7、（精确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP基因。有了cDNA，普通生物学研究者就较好应用，比用蛋白质以便多了。普腊石1992年刊登GFPcDNA后，不做科学研究了。她申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光先例，就是她找到了，也没什么价值。一气之下，她离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。当时她如果花几美元，就可以做一种普通研究生都能做，但是非常美丽工作：将水母GFP基因放到其她生物体内，例如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP自身可以发光，无需其他底物或者辅助分子。将GFP表达到其他生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫M

8、arty Chalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所两位日裔科学家Inouye和Tsuji。水母素和GFP均有重要应用。但水母素仍是荧光酶一种，它需要荧光素。而GFP蛋白质自身发光，在原理上有重大突破。Chalfie文章及时引起轰动，诸多生物学研究者纷纷将GFP引入自己系统。在一种新系统表达GFP就能在自然、科学上刊登文章，其实但是是跟风性质，没有原创性。纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修和约翰森研究遥遥领先，而很少人注意。如果其她生化学家乐意，她们也可以得到水母素和GFP，技术并不特别难。在1974年后来，特别是八十年代后，后继工作，诸多研究生都很容易做

9、。其中例外是钱永健实验室发现变种浮现新颜色，并非显而易见。绿色荧光蛋白应用1、骨架和细胞分裂 Kevin Sullivans 实验室 酵母菌内SPB 和微管动力学 酵母菌中肌动蛋白动力果蝇中MEI-S332蛋白果蝇有丝分裂和mRNA运送网丙菌属细胞骨架 RNA剪切因子核内运送网丙菌属趋化作用网丙菌属中细胞骨架动力和细胞运动核动力网丙菌属中细胞动力细胞骨架动力和胞内运送 2、细胞器动力学和泡囊运送用GFP显示小囊运送用GFP观测TGN运送细胞骨架动力学和胞内运送 3、发育生物学用GFP观测线虫神经发育分析果蝇神经发育不对称性细胞分裂线虫Lin-14Fischbach lab用GFP观测网丙菌属形

10、态发生学GFP在小鼠发育中标记办法 4、神经生物学神经极性发育 tracking intracellular transport of peptide neurotransmitters using GFP Allen LabEnhancer trapping using tau-GFP as reporter localized to axons5、其她应用Cell surface organization in Natural Killer cells Dan Davislocalization of calmodulin in S. pombe with GFPGFP-plakoglob

11、in and expression plasmids Klymkowsky labMolecular Motion Laboratory Yale UniversityMeasuring diacylglycerol in vivo with a GFP-PKC chimera Tobias MeyerBentley Lab using GFP for on-line bioprocess monitoring & controlTracking viral proteins with GFP fusions6、GFP vectors and technologyClontech Inc.Su

12、pplier of constructs for making GFP fusionsDeltaVision 3D microscopy platform optimized for imaging GFP in living cells in real timeGFP Expression Truly Amazing Web Site about GFP technologyUniversal Imaging Corp. makers of the MetaGFP image processing platformQuantum Biotechnologies IncSuppliers of

13、 GFP and BFP constructsGFP in ArabidopsisBabCo/Covance antibody to GFPLightools GFP plate illumination systemsGFP in Chlamydomonas 7、Other Interesting GFP LinksGFP Resources for TeachersPicture of Aequoria victoria，source of GFPStructure of green fluorescent proteinFull text of Yang et al Nature Structural Bio paperTable of GFP mutant formsOptics in Cell Biology 来自海洋礼物 绿色荧光蛋白在诺贝尔化学奖上，绿色荧光蛋白成了主角。诺贝尔奖委员会将化学奖授予美籍日裔科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健三人，以表扬她们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。在诺贝尔奖新闻发布会现场，发言人取出一支试管，置于蓝光灯之下，只见这支试管中物质发出了绿色荧光什么是绿色荧光蛋白？绿色荧光蛋白分子形状呈圆柱形，就像一种桶，负责发光基团位