配套K12高中生物 第1部分 微生物的利用 实验1 大肠杆菌的培养和分离学案Word文档格式.docx

1、培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。三、细菌的培养和分离1细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。2细菌的分离（1）划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8 h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。在固体培养基培养1020 h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面

2、上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？【提示】取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。（2）涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释105107倍，然后取0.1 mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下

3、，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。四、灭菌操作1各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌（1 kg/cm2压力、121 、15 min）处理，并在超净台上使用。注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。2各种培养基必须是无菌的。3细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。五、大肠杆菌培养

4、与分离的实验步骤1在两个250 mL三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上封口膜。将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15 min。2灭菌后待培养基冷却至60 时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？【提示】酒精灯火焰旁约10 cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。3扩大培养先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体

5、培养基中，封瓶后在37 每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。4划线分离用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37 ，恒温培养箱中培养1224 h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。5. 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 培养24 h后，置于4 冰箱中保存。微生物培养的基本条件1.培养基及其类型（1）培养基：概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。作用：在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满

6、足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。（2）培养基的种类划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂微生物的扩大培养、工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物（如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐）鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种

7、指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽）2.无菌技术进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。3消毒和灭菌的比较概念常用方法应用的范围消毒使用较为温和的物理或化学方法，杀死物体表面或内部的

8、部分微生物（不包括芽孢和孢子）煮沸消毒法：在100 开水中煮沸56 min一般物品巴氏消毒法：7075 煮30 min或在80 煮15 min对于一些不耐高温的液体，如牛奶化学药剂消毒法如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物（包括芽孢和孢子）灼烧灭菌：酒精灯火焰接种工具的灭菌干热灭菌：干热灭菌箱内160170 下灭菌12 h玻璃器皿、金属工具的灭菌高压蒸汽灭菌：121 条件下，灭菌1530 min培养基及容器的灭菌注：消毒与灭菌的最大区别是芽孢和孢子能否存活某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观

9、察计数。请回答与此实验相关的问题。（1）制备培养基：根据物理性质的不同，可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。对细菌进行大量的扩增，用_培养基进行培养；对细菌进行分离，用_培养基进行培养。（2）灭菌：在培养微生物时必须进行无菌操作，包括各种_都必须是无菌的。对它们进行灭菌，通常用_法灭菌。（3）接种及培养：接种时常用的工具是_和玻璃三角刮刀。 为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于_中培养，培养的温度设定在37 。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种_作为对照进行实验。（4）菌落观察计数：培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样

10、品中有_种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_。（5）选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐_细菌。【思路点拨】（1）细菌扩大培养用液体培养基，分离用固体培养基。（2）无菌操作包括所有的器皿要无菌，所有的培养基要无菌，接种过程要防止杂菌污染。实验室中常用高压蒸汽灭菌法。（3）接种时常用接种环，用恒温培养箱保持温度。在实验过程中，除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。（4）不同的菌落具有各自不同的菌落特征（如硬度、颜色、透明度、光滑度等。）（5）选

11、择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。【答案】（1）液体固体平面（2）器皿和培养基 高压蒸汽灭菌（3）接种环恒温培养箱无菌水 （4）多高（5）盐（或NaCl）1细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌（）A接种环、手、培养基 B高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环 D接种环、手、高压锅【解析】此题考查对无菌技术的掌握。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。【答案】C大肠杆菌的培养和分离1.LB

12、培养基的制备（1）计算：根据LB培养基配方的比例，计算配制50 mL 的培养基时各种成分的用量。（2）称量：准确地称取各种成分。即：蛋白胨0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化钠0.5 g，加水50 mL。（如配LB固体培养基，则再加1 g 琼脂）（3）制备空白斜面：将LB液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2 mL，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。灭菌后斜靠于平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。2进行大肠杆菌培养与分离操作（1）灭菌（2）制备LB固体平面培养基倒平板操作待培养基冷却至60 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体

13、操作描述如下：（3）扩大培养左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。将菌体放入三角瓶液体培养基中（将封口膜及斜面棉塞复原）。三角瓶在37 摇床振荡培养12 h。（4）划线分离取种在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。平板划线操作在LB固体培养基的平板上连续划线（如下图所示），划线后盖好培养皿。培养将上述划线操作后的培养皿倒置放至37 恒温培养箱中培养1224 h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。（5）菌种纯化与保藏在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37 培养24 h后，4 冰箱保存即可。划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体（菌落），从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散