实时荧光定量PCR具体实验步骤文档格式.docx

1、 浓度测定A260下读值为 1表示 40 g RNA/ml。样品 RNA浓度（ g/ml） 计算公式为： A260 稀释倍数 40 g/ml 。具体计算如下：RNA溶于40 l DEPC水中.取5ul.1:100 稀释至495l 的TE中.测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l 取 5ul 用来测量以后 . 剩余样品 RNA为 35 l. 剩余 RNA总量为：35 l 0.84 g/ l = 29.4 g纯度检测RNA溶液的 A260/A280的比值即为 RNA纯度.比值范围 1.8 到2.1。2）变性琼脂糖凝胶

2、电泳测定1制胶1g琼脂糖溶于 72ml水中.冷却至 60.10 ml 的 10 MOPS电泳缓冲液和 18 ml 的 37% 甲醛溶液 （12.3 M） 。10MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS.pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA灌制凝胶板 . 预留加样孔至少可以加入 25 l 溶液。胶凝后取下梳子 .将凝胶板 放入电泳槽内 . 加足量的 1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。2准备 RNA样品取 3 gRNA.加 3 倍体积的甲醛上样染液 . 加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml 。加热至 70孵育 15 分钟使样品变性。电泳 上样前凝胶须预电泳 5m

3、in. 随后将样品加入上样孔。 56V/cm电压下 2h. 电泳至 溴酚兰指示剂进胶至少 2 3cm。4紫外透射光下观察并拍照28S和 18S核糖体 RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA的物种类型）. 上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散 的带.它由低分子量的 RNA（tRNA和5S核糖体 RNA）组成。在 18S和28S核糖体 带之间可以看到一片弥散的 EB染色物质. 可能是由 mRNA和其它异型 RNA组成。 RNA制备过程中如果出现 DNA污染.将会在 28S核糖体 RNA带的上面出现 . 即更高 分子量的弥散迁移物质或者带 .RNA

4、的降解表现为核糖体 RNA带的弥散。用数码 照相机拍下电泳结果。3样品 cDNA合成1反应体系序号 反应物 剂量1逆转录 buffer 2l2上游引物0.2 l3下游引物4dNTP0.1 l5逆转录酶MMLV 0.5 6DEPC水5l7RNA模版2l8总体积10l轻弹管底将溶液混合 .6000rpm 短暂离心。2混合液在加入逆转录酶 MMLV之 前先 70干浴 3 分钟. 取出后立即冰水浴至管 内外温度一致 . 然后加逆转录酶 0.5 l.37 水浴 60分钟。3取出后立即 95干浴 3 分钟. 得到逆转录终溶液即为 cDNA溶液.保存于-80 待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（

5、-actin ）实时定量 PCR1 -actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011.反应前取 3l 按 10 倍稀释（加水 27l 并充分混匀）为 1010. 依次稀释至 109、108、107、106、 105、104. 以备用。2反应体系如下： 标准品反应体系序号反应物 剂量SYBR Green 1 染料10阳性模板上游引物 F0.5 阳性模板下游引物 RdNTP 0.5 lTaq 酶 1l阳性模板 DNA 5 lddH2O 32.5 l总体积 50 l管家基因反应体系：1SYBR Green 1 染料 10 l2内参照上游引物 F 0.5 l3内参照下游引物 R 0.5

6、 l4dNTP 0.5 l5Taq 酶 1l6待测样品 cDNA 5 l7ddH2O 32.5 l8总体积 50 l3制备好的阳性标准品和检测样本同时上机 .反应条件为： 93 2 分钟. 然后 93 1 分钟.55 2 分钟.共 40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA模板针对每一需要测量的基因 . 选择一确定表达该基因的 cDNA模板进行 PCR反应。 反应体系：110 PCR 缓冲液 2.5 ul2MgCl2 溶液 1.5 ul3上游引物 F 0.5 ul4下游引物 R 0.5 ul5dNTP混合液 3 ul6Taq聚合酶 1 ul7cDNA 1 ul8加水至总体积为 25u

7、l35个PCR循环（ 941分钟； 551分钟； 721分钟）； 72o C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder 在2琼脂糖凝胶电泳 .溴化乙锭染色.检测 PCR产物 是否为单一特异性扩增条带。3将 PCR产物进行 10 倍梯度稀释 : 将 PCR产物进行 10 倍梯度稀释 : 设定 PCR 产物浓度为 11010. 依次稀释至 109、108、 107、106、105、104 几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量 PCR所有 cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下：1SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物 1ul3下游引物 1ul4dNTP

8、1ul5Taq 聚合酶 2ul6待测样品 cDNA 5ul7ddH2O 30ul8总体积 50 ul将配制好的 PCR反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR扩增反应。反应条 件为： 932分钟预变性.然后按 93 1 分钟.551分钟.721分钟.共40做 个循环.最后 727分钟延伸。7实时定量 PCR使用引物列表 引物设计软件： Primer Premier 5.0. 并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密 互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构； 引物不在模板的非目 的位点引发 DNA 聚合反应 （即错配）。8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realt

9、ime PCR 反应。 PCR产物与 DNALadder在 2琼脂糖凝胶电泳 .GoldView ? 染色. 检测 PCR产物是否为单一特异性 扩增条带。实时荧光定量 PCR 组织RNA提取：一般认为 100mg肝组织提取 RNA 500ng.100m肺g 提取RNA 200ng.脑内的RNA丰 度适中 .100mg脑组织 . 提取RNA 5-200ng。所以一个 10mg的海马可匀出 RNA约为 20ng。反转录反应反转录反应参照 TaKaRa RT-PC说R 明书。反转录反应条件如下。37 C 15 min （反转录反应）85 C 5 sec （反转录酶的失活反应） Real Time P

10、CR 反应选用脑源神经营养因子（ BDNF）为目标基因 .核糖体18S rRNA（18S rRNA）做 为内参。基因引物序列扩增片段长 度NR2BNR2B（+）CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bpNR2B（）ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRNA18s rRNA（+）TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198 bp18s rRNA（）CGTTTATGGTCGGAACTACGA1） 按下列组份配制 PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）试剂使用量终浓度? TM12.5 l1SYBR Premix Ex Taq （ 2）PCR Forward Primer

11、（10 M）1 l0.4 MPCR Reverse Primer （10 M）模板（ cDNA溶液）0.5 ldH2O10 lTotal25 l全班40人.分为5组.每组做 8管。4管做BDNF.4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA.采用相应的正反 PCR引物。每种基因做两个模板 . 一个模板采用原液浓度 . 一个模板采用稀释一倍浓度 .体积均为0.5 l 。2）三步法 PCR首先95C 作用3 minPCR 进行 35 个循环。步骤温度时间变性95C30 秒退火58延伸72融解曲线变温速度0秒20C/秒5515秒0.1 PCR疑难解答当 PCR结果不甚满意时 . 首先检查以下几方面并遵照执行：1将 PCR反应的试管与反应板紧贴。2当酶反应混合物以 70“热启动”开始循环时 . 切记在加入酶后稍 3 微振荡一 下.因为在 0.2-ml 的 PCR管中不能均匀传热。4不要随意减少 dNTP的用量 . 它是一个系统的因素 .必须与其它成份保持平衡。5对于有问题的 PCR反应. 例如模板的量少 .模板不纯和环状模板等 .先尝试加 Taq 酶前的体系进行预变性 . 后加模板进行正常 PC