CoIP.ppt

1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）,制作者：徐君丽,My Name is protein,免疫沉淀（Individual protein immunoprecipitation,IP）：利用抗体特异性从细胞裂解物或其他可溶性生物样品中纯化已知特定蛋白质。2)免疫共沉淀（Protein complex immunoprecipitation,Co-IP）：利用抗体沉淀相应特定抗原，同时沉淀与该抗原相互结合的其他分子，主要用于研究蛋白质相互作用。3)染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）：在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物

2、，并将其随机切断，通过免疫沉淀复合体特异性富集目的蛋白结合的DNA片段，再通过对DNA片段的纯化和检测，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。4)RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）：其原理与ChIP相近，但RNA免疫沉淀是用来研究与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用。,免疫沉淀技术分类,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。,原理,利用共价结合蛋白A或蛋白G的琼脂糖或磁性微球将反应后的抗原-抗体复合

3、物富集纯化。蛋白A和蛋白G能特异地和抗体的保守区Fc段结合，形成稳定的抗原-抗体复合物附着在微球上，溶液内无关的分子可以通过洗涤微球被清除，最后，再采用一系列方法分析纯化抗原或与抗原结合的其他分子。,1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。,1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性

4、。,优点,缺点,免疫沉淀实验成功的关键在于第一步样品处理。免疫沉淀实验本质是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中抗原的质量，如抗原的丰度及抗原的构象状态。,1,在考虑抗体特异性的同时，还需考虑抗体对抗原的亲和力，如单克隆抗体只对抗原的单一表位具有良好的特异性，因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分，受到破坏，或受其他因素影响，造成抗体不能识别抗原，无法有效形成免疫沉淀复合物，那么这将直接影响免疫沉淀的结果。而多克隆抗体或混合单克隆抗体可以和抗原的多个表位结合，从而解决亲和力的问题。,2,目前广泛应用于免疫沉淀的微球以结合了蛋白 A或G的琼脂糖和磁性微球为

5、主。在免疫沉淀操作中需要采用离心的方法达到固液分离，而反复离心产生的物理应力极易破坏蛋白的天然构象及完整性，磁性微球可以在外加磁场中表现磁性，实现快速有效分离，大大缩短实验操作时间。温和的磁性分离方式避免反复离心对蛋白天然构象及完整性的破坏。,3,1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（Np40或Triton x-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 4）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；5）要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；6）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。,注意事项,