一个名不见经传的中国团队做出了 Nature 级别的科研成果文档格式.docx

1、）这项成果本身很有价值，而且好事多磨，经过切磋琢磨做得质量很高，这种做研究的态度值得在当下这个氛围中大书特书。当然是不是像有些人说的目前就已经“划时代的技术打脸 CRISPR”，打破“美国技术垄断”（虽然 Addgene 上随便买其实也没有进张峰的腰包），我想虽然有很多充满情怀的言论，但是单纯从学术角度而言，NgAgo 是否可以媲美 CRISPR，我想言之尚早。目前来看这个研究成果是否有更大前景还要观望。我想大部分关注 CRISPR 的朋友应该都还对 2014 年那篇 DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute 有一些印象，其实

2、那时很多人的态度也是再观望一下，我记得当初实验室里做 CRISPR 的 review 报告的时候还提了一下说现在发现 DNA 也可以介导定点内切了。现在经过两年观望，我们观望出了这样一项成果，可以说很欣喜的是它在往好的方向发展，希望能够保持这种势头。一项 DNA 编辑技术是否有优势涉及到方方面面。从目前的情况来看，NgAgo 的优势很明显，主要体现在1）反应效率不低（不说高，但不低）2）特异性较好（即常说的脱靶率）3）不依赖 PAM4）NgAgo 本身分子量不大另外还有一些文章中作为优势，但也可能是劣势的性质（比如使用 ssDNA 介导，提高特异性同时会带来很多问题）不论如何优势是明显的，但是

3、仅仅这些方面并不够，还需要研究更多问题，比如特异性好是有限实验基础上的理论结论，实际应用脱靶率如何要看具体情况。目前来看有几项事关这项技术未来的、优先待验证的问题是：1）系统正交性2）多位点编辑能力3）NgAgo 蛋白的模块化程度（工程化改造的潜力）4）ssDNA 的通用性和缺点不要小看上述问题，条条都是卡脖子的，一条不给力就会被 CRISPR 比下去。很多人知道 CRISPR 很火，也知道 CRISPR 是很好的基因组编辑工具，容易以为基因编辑工具本身是很牛的，实际上 CRISPR 之所以火，还有很大一部分原因在于高正交性、高通用性、高工程化潜力带来的广泛应用，诸如转录后调控、人工 TF 等

4、等。核酸定点内切是一个基础性质，带来了上述性质的可能性，需要经过验证才能就是否可以作为 CRISPR 的替代技术有一个结论。比如在不同物种细胞系统中的正交性如何？目前知道 Ago 在真核到原核细胞中广泛存在同源基因，这个在文章中是作为某种优势来讲的，但实际上可能是一个劣势。因为正交性问题，在人类细胞中好用未必在其它物种平台中好用。大家可能注意到了，文章开篇第二个实验就是做了一个简单的正交性测试，测试结果还不错，文中提到which implies that there is very limited 5 phosphorylated ssDNA present in human cells, s

5、uggesting that endogenous ssDNAs will not mislead NgAgo to off-target sites这当然不足以说明 NgAgo 具有高正交性，作者也用了 implies 的措辞，还有待进一步证实。可以从文中看出，作者最担心的问题其实也是系统正交性，在文章最后，作者特意强调需要进一步的高通量实验来研究这个问题，可见作者并非没有意识到，而是受限于时间或其它科研条件。除此之外，多位点编辑能力是 CRISPR 的一项重大优势。我们现在知道 NgAgo 和 ssDNA 的结合是非常稳定的（在 37条件下不可逆），这当然是某种提高特异性的优势，但稳定也是

6、双刃剑，有可能成为劣势。文中提到：similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound oligos with free oligos at 37 C这样的性质是否会影响到 NgAgo 在多位点编辑中的反应效率不得而知。我看到大部分评论都没有提到这个问题。CRISPR 还有一个亮点是 Cas9 的模块化性质。可以容许进行较多的蛋白工程改造，NgAgo 是否有这样的高度模块化的性质也将直接决定这项技术能否问鼎优秀 DNA 编辑技术的地位。如果对蛋白质工程设计的可扩展性不好，那么其应用很有可能受限。最后还有 ssDNA 在各种细胞平台

7、中如何使用等问题，我们现在知道 CRISPR 系统常导入 gRNA 或通过 sgRNA transcription vector 来制造介导核酸，DNA 显然不能用这招，直接导入 DNA 本身就限制了 NgAgo 在一大类物种当中的应用潜力。有同学展望天然的 5p-ssDNA 的加工机制未来可以利用，然而文章中提到人类细胞中 5p-ssDNA 并不丰富。这有利于系统正交性，却也暗示 ssDNA 的使用有可能成为这项技术的一个瓶颈。有一位答主说 ssDNA 的用量只要 CRISPR 技术中 RNA 用量的 1/10，这显然是英文不好造成了误读，文章中原文是：if the sgRNA is exp

8、ressed from a plasmid and the normal dosage of an ssDNA guide is only 1/10 of that of a sgRNA expression plasmid可见，特异性 ssDNA 在这项实验中是可以通过使用浓度饱和来增强 NgAgo 的特异性的（与破坏正交性的 ssDNA 竞争性结合 NgAgo），但是这个 robustness 是一柄双刃剑。DNA 分子本身的稳定性、系统的鲁棒性和使用方式会影响这个系统的可控性。一旦系统可控性不好，基本上会被最重要的生物医疗领域排除在外。这个方面在另外一个姊妹问题下 张浩千 阐述得比我高得

9、多，值得学习。从合成生物学角度看，这有可能是得不偿失的。还有一个有趣的点，就是 NgAgo 存在随机移除切点附近核酸的性质，这样的性质能不能通过酶工程加以优化，这些都需要进一步研究。（Figure from Feng Gao, Xiao Z Shen, Feng Jiang, Yongqiang Wu, Chunyu Han）上述问题都是 NgAgo 成为一项优秀基因编辑技术道路上仍需接受的考验。希望未来可以一路顺利。我觉得韩春雨老师有一个想法是对的，就是一旦发表，有兴趣的实验室会很快跟进去做这些工作。国际上一些合成生物学实验室资源极优，竞争力很强，所以无论这个低温 NgAgo 蛋白潜力如何，

10、很快就会有结论。不必着急，是金子总会发光。P.S. 很多人说这个成果没上 Science 是学术壁垒，是 Science 瞎眼。有可能，国际学术壁垒黑幕还是很多的，但也不尽然。因为从上面的分析来看，它还有很多不确定性，除了优势外还有很多尚不确定能达到 CRISPR 同等能力的方面。当初投稿 Science 的时候，据知识分子报导，可能实验并没有现在全。如果在 2012 年，那么它无疑可以上 Science，但是在全球对 CRISPR 都已经有深刻认识的今天，新的基因编辑技术必然面临更高的要求。需要指出的是，之所以本文章最大的贡献是找到了低温 Ago，而不是发明了这项技术，是因为用 ssDNA

11、介导 Ago 蛋白作为 DNA 编辑工具由来已久，7 年前，University of Freiburg iGEM 已经有本科生团队做过类似的工作。（Figure from Team:Freiburg bioware/Project - 2009.igem.org）目前为止的一个重大意义恐怕在于它是在研究条件相当一般的实验室中实现的，这是很值得重视的一件事。再次拷问了我国的科研经费分配体系。有的大几百万的项目给某个海鲜搞个全基因组图谱搞个文库什么的（不是说分子育种不重要不该花钱，而是说一些创新度高的研究分不到钱）。国内还有一些合成生物学研究却无法摆脱传统基因工程的影子，用合成生物学的瓶子装基因

12、工程的酒，这是非常遗憾的。查看知乎原文（18 条讨论）韩春雨团队在Nature Biotech上发表的 NgAgo 基因编辑技术是什么？有何突破？张浩千，合成生物学家对于生物学技术，要针对科研和应用需求，深入了解细节再进行判断，不能人云亦云。同意 Yang Liu 的谨慎态度，部分同意 孟浩巍 的乐观分析。NgAgo 的缺点其实是很明显的：只能切割 ssDNA 和具有负超螺旋构象的 DNA（SC DNA，比如质粒），对于线性化双链 DNA 是没有切割活性的。这说明：一，NgAgo 无法用于 dsDNA 在体外温和环境下的编辑处理，因此很难用于开发相关的体外分子生物学工具，这比起 Cas9 是一

13、大劣势；二，在分裂生长不迅速的细胞中，基因组上 ssDNA 的暴露有限，基因组 DNA 的 SC DNA 比例不高，因此 NgAgo 很有可能也无法进行有效编辑。此外，在生物医疗应用中，向人类细胞中导入外源 DNA 是很忌讳的，CRISPR-Cas9-sgRNA complex 导入人体细胞后不会在细胞中长期存在，而 NgAgo 的 gDNA 导入细胞后可能会被整合到基因组上，进而带来 ethic issue，这一点也是不能忽略的。至于为什么 NgAgo 只能切割 ssDNA 和 SC DNA，原因很可能正是 NgAgo 没有 PAM 序列依赖性。从前些时候发表的 CRISPR-Cas9 的单

14、分子观测可以知道，PAM 对于 Cas9 的作用可不单是位点识别，更重要的是 gRNA 与 DNA 的结合起始处；也就是说，PAM 处先打开一小段，让 gRNA 的 seed sequence 做 strand invasion，然后整条 gRNA 才能达成对于 target sequence 中 DNA 双链的打开和替换，整个过程相当于通过 PAM 实现了一个动力学上进行快速 target binding 的路径；换言之，PAM 的依赖性是 Cas9 在 editing feasibility 和 target binding kinetics 之间进行妥协平衡的结果。NgAgo 没有 PA

15、M 依赖性，而文章 Supplementary Fig. 3 也表明 NgAgo 确实无法切割线性化的 DNA，但对于双螺旋结构不稳定的 SC DNA 和没有双螺旋结构的 ssDNA，NgAgo 却具有正常切割活性，这些结果强烈地暗示，没有 PAM 的代价就是 NgAgo 无法单靠自己的力量打开正常 dsDNA 的双链结构。我们再看看能够切割 DNA 的 bacterial argonaute 的来源，都是极端嗜热古生菌和极端嗜盐古生菌。嗜热古生菌的生存温度通常在 60 摄氏度以上，这种温度下 DNA 双链结构本身就不稳定（类似于我们做 PCR 的环境）。NgAgo 来源于极端嗜盐古生菌，我将其蛋白质序列用于 NCBI non-redundant protein database 的检索，得到 BLAST 结果的前十都是极端嗜盐古生菌，其基因组的 GC 含量均在 60%以上。以前的生化知识告诉我们，当 DNA 的 GC 含量较高，且位于高盐浓度环境中时，DNA 的负超螺旋比例会显著提高；因此这